Быстрое высокой пропускной метод картирования рибонуклеопротеиды (мяРНП) по правам пре-мРНК

Summary

Из-за переходного характера пре-мРНК, это может быть трудно выделить и изучать

Abstract

Секвенирование РНК, которые совместно иммунопреципитации (со-IP) с РНК связывающих белков увеличилась наше понимание сплайсинга, продемонстрировав, что обязательным месте часто влияет на функции сращивания фактор. Однако, как и любая стратегия выборки шанс выявления РНК связаны с фактором сплайсинга пропорциональна его сотовый изобилии. Мы разработали новый подход в пробирке для съемки специфичность связывания по иным переходных пре-мРНК. Этот подход использует специально разработанные олигонуклеотидных пула, плитки по интроны, экзоны, сращивание переходов, или другие пре-мРНК. Бассейн подвергается какой-то молекулярной селекции. Здесь мы демонстрируем метод, разделив олигонуклеотида в связанные и несвязанные фракции и использовать два цвета массива стратегии для записи обогащение каждый нуклеотид в связанной фракции. Массив данных генерирует высокое разрешение карты с возможностью определить последовательности конкретных и структурных determinates из рибонуклеопротеидных (RNP) обязательны для пре-мРНК. Уникальное преимущество этого метода состоит в его способности, чтобы избежать предвзятого отношения к выборки мРНК связано с текущими IP и SELEX технике, как бассейн, специально разработаны и синтезированы из пре-мРНК последовательности. Гибкость олигонуклеотидных бассейн является еще одним преимуществом поскольку экспериментатор выбирает, какие регионы для изучения и плитки в поперечнике, пошив бассейн с их индивидуальными потребностями. Используя эту технику, можно анализе эффектов полиморфизма или мутаций на обязательными для крупных размерах или клон библиотеки в функциональном репортер сплайсинга и определить, что олигонуклеотиды обогащены включены фракции. Этот роман в пробирке с высоким разрешением схема отображения представляет собой уникальный способ изучения RNP взаимодействия с преходящими пре-мРНК видов, которых низкое содержание затрудняет их изучение с действующим в естественных методов.

Protocol

Дизайн бассейна и олиго восстановления

1. Первый шаг заключается в разработке пре-мРНК бассейн предстоит изучить. Это может быть сделано с помощью браузера УСК геноме и загрузку определенных генов, сращивания переходы, или других областей, представляющих интерес.
2. После окон ставки были выбраны, плитки через них вычислительно использованием следующих условий: читайте длина должна быть 30 нуклеотидов с 10 нуклеотидных перекрываются, поэтому каждый олиго сдвигается 20 нуклеотидов по сравнению с предыдущим один. * Олиго перекрытия должна быть увеличена в непосредственной близости от сращивания участков для обеспечения адекватного охвата, увеличение перекрытия от 10 до 20 нуклеотидов можем достичь этого.
3. Пашина каждый 30-нуклеотидных олиго с универсальной последовательности праймера, который будет использован для усиления бассейна вниз по течению. Плиточные заказов олиго должны быть представлены Agilent, где последовательности будут напечатаны на пользовательские микрочипов олигонуклеотида.
4. Для восстановления ДНК олигонуклеотидов из микрочипов поверхности начинают путем размещения слайд массив покрова в камеру гибридизации массива и мягко пипетки 500 мкл дН ₂ O на слайд
5. Сэндвич массива на верхней части крышки слайд, избегая пузырьков воздуха, которые могут нарушить процесс. Не забудьте разместить массив лицевой стороной вниз так бок с олиго касается поверхности воды. Хорошее правило: "Agilent касается Agilent", что означает, что на этикетке Agilent на массиве лица этикетке Agilent на обложке слайд
6. Закрыть гибридизации камере и вращаются в течение ночи при 99 ° С в печи гибридизации
7. На следующий день, тщательно удалить массив из камеры и отводить воду, которая теперь содержит олиго освобожденных из массива поверхности. Это бассейн олиго
8. Место бассейн в 1,5 мл трубки Эппендорфа и разрушать ультразвуком бассейн на 50% амплитуды на 3-5 секундные импульсы
9. Далее, усиливают бассейн низкой цикла ПЦР, с помощью универсального праймера с тегом T7 добавляются в конец. Для первого тура, денатурации при 94 ° С в течение 1 минуты, отжиг при температуре 55 ° С в течение 20 секунд, а удлиненная в течение 1 минуты при 72 ° C. Для последующих раундах, не 10 секунд, 20 секунд и 10 секунд в каждой соответствующей температуры, с Заключительным шагом удлинение 5 минут при 72 ° C. Потому что количество циклов необходимых для усиления бассейна зависит от эффективности восстановления олиго, это может быть стоит попробовать несколько номеров цикла. Будьте осторожны, чтобы не чрезмерно усиливать пруда, который обозначается смазанные полосы на акриламида гель. ПЦР усиливается образцы можно хранить при температуре 4 ° С до необходимости.
10. Последним шагом в подготовке олиго является для транскрипции РНК с использованием комплекта MEGAshortscript ™ от Амбион. * Следующий протокол был адаптирован с Амбион
    1. Оттепель T7 10x Буфер реакции, четыре рибонуклеотид растворов и воды при комнатной температуре, сохраняя при этом Mix T7 ферментов на льду
    2. Соберите реакционной смеси в РНКазы без микроцентрифужных трубки при комнатной температуре. Компоненты реакции буфера может привести к ДНК-матрицы для осаждения, если реакция смешанной со льдом.
    3. В следующем порядке, пипетки 3 мкл нуклеазы без воды, 2 мкл 10х буфера реакции, 2 мкл каждого 75 мМ раствор NTP, 5 мкл ДНК-матрицы (ПЦР усиливается олиго бассейн) и 2 мкл фермента Т7, для конечного объема 20 мкл
    4. Флик трубки осторожно смешать реакции затем кратко микроцентрифужную собрать смесь в нижней части трубы.
    5. Инкубируйте реакцию в амплификаторе при температуре 37 ° С в течение 2 часов. Время инкубации будет шаблон-зависимыми, поэтому она может быть необходимо использовать время курса эксперимент, чтобы определить оптимальное время инкубации в течение максимальный выход
    6. Через 2 часа, удалить шаблон ДНК, добавляя 1 мкл ДНКазы Turbo реакции и инкубировать при температуре 37 ° С в течение дополнительных 15 минут
    7. Завершить реакции и восстановления РНК фенол / хлороформ добычи и осаждением этанолом.
       1. Для 20 мкл объем реакционной смеси, добавьте 115 мкл дН ₂ O и 15 мкл 3 М ацетата натрия в реакцию.
       2. Тщательно перемешать затем добавить 75 мкл кислого фенола и 75 мкл хлороформа. Смешайте раствор вортексе, то микроцентрифужную в течение одной минуты при 13000 оборотов в минуту при комнатной температуре. Передача водный слой в новую пробирку и повторить извлечение
       3. Передача водный слой в новую пробирку и добавляют 150 мкл хлороформа. Vortex смеси и центрифуги, как раньше. Передача водный слой в новую пробирку.
    8. Восстановление РНК путем добавления двух томов из 100% холодного этанола водный слой и замешивая хорошо. Холод смесь в течение минимум 15 минут при температуре -20 ° С, затем центрифуги при 4 ° С в течение 15 минут при максимальной скорости для осаждения РНК. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 105 мкл 0.1x Трис-ЭДТА (TE) буфера ..
11. Трудно, чтобы удалить все свободные нуклеотиды из реакционной Kit T7, так и для наиболее точных результатов, количественно РНК с использованием RiboGreen.
    1. Для начала количественного, во-первых разбавленных достаточно 1x Т.Е., 2300 мкл + 50μL/sample.
    2. Затем, сделайте RiboGreen. Вам понадобится 1000 мкл + 50 мкл / образца. За высокие образцы диапазона (1 мкг / мл до 20 нг / мл) смешивают RiboGreen 1:200 в 1x TE, ибо низкие образцы диапазона (50 нг / мл до 1 нг / мл) смешивают RiboGreen 1:2000 в 1x TE ; 50 мкл RiboGreen раствора в каждую лунку непрозрачной пластины, начиная с А1 и двигаться вниз, а не на
    3. Разбавьте раствор РНК акции до 2 мкг / мл для высоких образцов диапазона или 100 нг / мкл для низкого диапазона образцы
    4. Использование растворы, создайте стандартную кривую шести последующих 1:02 разведения оригинальная 2 мкг / мл и 100 нг / мл состава; Внесите 240 мкл акций в трубку полосы ПЦР. В остальных 7 трубки, пипетки 120 мкл ТЕ-1x. Возьмите 120 мкл с фондового РНК хорошо, и смешать с трубой 2. Возьмите 120 мкл из трубки 2 и смешать с трубкой 3. Повторяйте, пока труба 7. Труба 8 будет иметь только ТЕ-и будет вашим пустым. Внесите 50 мкл стандартных решений кривой в непрозрачной пластины, A1: H2 (запустить кривой дважды)
    5. В новой трубке, смешайте 45 мкл ТЕ с 5 мкл бассейн олиго и добавить все 50 мкл, чтобы хорошо, что содержит 50 мкл RiboGreen.
    6. Использование ридер настроить аппарат читать флуоресценции сверху после одной минуты смешать с возбуждением волны 485 нм и длине волны излучения 530 нм и читать пластины
    7. Использование стандартной кривой, полученной для количественной оценки восстановления РНК, которая должна храниться при температуре -20 ° C.

Сотрудничество иммунопреципитации бассейн олиго с RNP интерес

1. Перед началом совместной иммунопреципитации, подготовить белка и протеина G Dynabeads от Invitrogen, смешивая их в соотношении 1:1 до конечного объема 50 мкл на реакцию. Например, для двух реакций необходимо добавить 50 мкл каждого из каждой шарик.
2. Использование магнитных Стенд Разделение, как этот от Novagen провести бисером на месте во время удаления надосадочной и мыть бисером дважды с равным объемом холодной 1x PBS
3. После второго мытья, ресуспендируют бусины равным объемом холодной 1x PBS и добавьте 2 нг антител в реакции. Эта сумма может варьироваться в зависимости от антител, поэтому эксперименты необходимо найти оптимальные условия.
4. Инкубируйте антитело / бусинка смесь на ночь при 4 ° С на вращающейся платформе
5. Утром добавьте 2 мкг на реакцию ультразвуком РНК общего дрожжи, чтобы блокировать неспецифическое связывание и поверните еще в течение 30 минут при 4 ° C.
6. Использование магнитной стойке провести бусы, удалите супернатант и мыть дважды бусин с холодной 1x PBS, в результате чего PBS со второго мыться в трубке.
7. Выньте новые трубы, по одному для каждой реакции и аликвоту 50 мкл шарик смеси в каждую пробирку. Пусть бисером сидеть при подготовке мастер смеси
8. Для каждой реакции добавить 200 нг олиго бассейн, эквимолярном отношении защиты грунтов, 2 мкг ультразвуком дрожжи общей РНК, 20 мкл HeLa ядерный экстракт (это RNP источник), и буферных E довести объем до 120 мкл. Защита праймеры РНК версии универсальной грунтовки. Заказ транскрипции шаблоны универсальных праймеров с тегом T7 добавляются в конец, то транскрибировать РНК из шаблонов с помощью MEGAshortscript ™ Kit.
9. Удалить супернатант из бусинка аликвоты и ресуспендируйте бисером в 120 мкл мастер микс. Рок реакции при 4 ° С в течение 1-2 часов.
10. После инкубации, для каждой реакции, удалить небольшие аликвоты (в том числе бисером) для "общего" образца РНК
11. Место оставшейся части реакций на магнитной сепарации стоять и удалите супернатант. Хотя это и не нужно проанализировать это проточный образец вниз по течению, она может быть полезна для сохранения.
12. Вымойте бусин 1-2 раза по 50 мкл холодного 1x PBS. РНК связаны с антителом на бисера "IP" образца.
13. Ресуспендируют "общего" и "IP" шарики в 50 мкл 1% SDS в буфере TE 0.1x и тепла образцов при 65 ° С в течение 15 минут элюции РНК.
14. Удалить супернатант, который теперь содержит РНК, которая ранее была связана с бисером и чистоте, фенол / хлороформ добыче следуют осаждением этанолом. Сухие гранулы и ресуспендируют в 50 мкл буфера ТЕ 0.1x.

Обратная транскрипция и усиление совместного IP образцов в рамках подготовки к aminoallyl маркировки

1. Далее РНК пробы должны быть обратной транскрипции и ПЦР усиливается. Для обратной реакции транскрипции, используйте обратную универсальных праймеров.
2. Для каждого образца, начинают путем смешивания 1 мклобратном универсальный грунт, с 1 мкл матричной РНК (от иммунопреципитации реакции) и 10 мкл дН ₂ O. Тепло реакции при 70 ° С в течение 5 минут, затем холод на льду или хранить при температуре 4 ° C.
3. Хотя образцы прохладно, сделать следующие Mix Master. Для каждой реакции объединить 4 мкл 10 мМ дНТФ, 2 мкл 10х буфера Arrayscript, 1 мкл ингибитора РНКазы и 1 мкл фермента обратной транскрипции. Тщательно перемешать и добавить 8 мкл мастер микс на каждой обратной реакции транскрипции.
4. Использование ПЦР машины для инкубации образцов при 42 ° С в течение 2 часов, затем 95 ° С в течение 5 минут, затем 4 ° С до образцов, необходимых для усиления.
5. После обратной расшифровки РНК проб, ПЦР усиливать их, используя универсальные грунтовки, с одним из праймеров содержащие теги Т7. Количество циклов необходимых для усиления бассейна будет зависеть от эффективности совместной IP так что может быть стоит попробовать несколько циклов. Каждая реакция требует 5 мкл 10х буфера реакции Taq, 0,2 мкл каждого праймера (100 мм), 1 мкл кДНК шаблон (с обратной реакции транскрипция), 1 мкл 10 мМ дНТФ, 42,2 мкл дН ₂ O, и 0,4 мкл фермента Taq.
   
   Начните ПЦР путем инкубации образцов при 94 ° С в течение 3 минут. Далее, для каждого цикла, денатурации при 94 ° С в течение 45 секунд, отжиг при температуре 55 ° С в течение 30 секунд, а удлиненная на 72 ° C в течение одной минуты, с окончательным удлинение при 72 ° С в течение 10 минут.
6. Затем записать образцы еще раз, используя комплект MEGAshortscript ™, однако, на этот раз добавляют 2 мкл aminoallyl UTP, вместо Т7 UTP. Aminoallyl UTP будет использоваться для обозначения РНК с Су красителей.
7. Фенол / хлороформа и этанола осадок образцов. НЕ используйте Glycoblue или ацетата аммония, оба из которых могут помешать гибридизации образцов массива. Сухие гранулы и ресуспендируют в 4,5 мкл 0,1 М карбоната натрия.

Amino-аллил маркировки РНК с Красители Су

1. Для начала маркировки протокола раствориться каждый из флуоресцентных красителей, Cy3 и Cy5, в 45 мкл ДМСО. Чтобы избежать свет, оберните трубы в алюминиевую фольгу и хранить при температуре -20 ° С в темноте
2. Добавить 2,5 мкл нуклеазы без воды РНК пробы и тщательно перемешать
3. Затем добавить 3 мкл Cy3 к "тотальной" образца, и 3 мкл Cy5 к "IP" образца. Инкубируйте образцы в темноте в течение 1 часа при комнатной температуре, Су-3 образца станет красной или розовой в то время как Су-5 станет синим.
4. Для прекращения реакции, добавить 6 мкл 4 М гидроксиламин-HCl к каждому образцу, тщательно перемешайте и спин кратко. Инкубировать 15 минут при комнатной температуре.
5. Purify меченых образцов фенол / хлороформ добыче следуют осаждения этанолом и ресуспендируют осадок в 50 мкл ТЕ 0.1x

Гибридизации образцы микрочипов использованием гибридизации Agilent массива Kit

1. Начните гибридизации, осторожно смешивания 50 мкл блокирующего буфера 10x, 140 мкл нуклеазы без H2 _O, 25 мкл Cy-3-с надписью "общего" пула, 25 мкл меченных Cy5 "IP", бассейн, 10 мкл 25x Буфер фрагментации и 250 мкл буфера 2x гибридизации, заботясь, чтобы избежать введения пузыри. Микроцентрифужную образец кратко собрать раствор в нижней части трубки, а также уменьшить пузыри.
2. Место уплотнительное кольцо крышки слайда в гибридизации камеры и осторожно пипеткой раствор на слайде.
3. Место обнаружения массива на верхней части крышки слайд «сэндвич» решение. Не забудьте сориентироваться массив слайд так, чтобы этикетка Agilent на массиве лица этикетке Agilent на обложке слайда.
4. Зажим слайд / массив бутерброд в гибридизации камеру и поворачивать на 50 ° С в течение 3 часов.
5. Хотя массив вращается, выполните следующие 50 мл решения в 50-мл конические пробирки: одна коническая заполнены 50 мл дН ₂ O, два 1x ГТК буферных растворов, каждый в отдельной трубе, и один 2x ГТК буфера.
6. После трехчасовой инкубации осторожно разжимать массив / слайд бутерброд и поместить его в 50 мл коническую содержащие 2x буфера ГТК. Использование пинцетом, осторожно отделить от массива крышку слайд и вытащить крышку слайд. Будьте осторожны и не прикасайтесь массив в качестве слайд вытащил. Закрыть конические и аккуратно переверните на 60 секунд.
7. Использование пинцета, передача массива к решению ГТК 1x, крышка трубки, и аккуратно переверните в течение 1 минуты затем передать массив второе решение 1x ГТК и снова аккуратно переверните на другую минуту.
8. Наконец, передача массива в трубки дН ₂ O и аккуратно переверните на 30 секунд.
9. Сухой массив, помещая края скользят по Kimwipe. Продолжайте вращать массив протрите убедившись, что не нарушают стороны содержащих олигонуклеотидов.
10. Место сухое массива впустой 50-мл коническую трубку и сканирования с помощью сканера Microarray

Интерпретация Microarray

1. Сканер микрочипов позволит создать TIF образа массива. Запустите этот образ с помощью извлечения пакета программного обеспечения Agilent, с использованием сетки файл (поставляется Agilent), который является уникальным для вашего конкретного бассейна.
2. Программное обеспечение Agilent будет интерпретировать сигнала на каждой функции для создания файла, и при анализе с Perl скрипт. Сигнал на каждую возможность нормализации в общую интенсивность на этом канале. Например, на особенность в зеленом канале, интенсивность зеленого канала для отдельных функций делится на общую интенсивность зеленого канала над всеми функциями. Окончательный выход журнала отношение красного канала на зеленый канал при каждой функции в массиве.
3. Бассейн олиго данные из микрочипов может быть повторно сопоставлены обратно в геноме, чтобы получить картину того, где и насколько сильно, RNP интерес связан.

Рисунок 1. Экспериментальные схемы

А. Черепица схеме. После выбора и загрузки пре-мРНК последовательности интересов, выбора области черепичными через в 30 нуклеотидных окна, сдвиг в 10 нуклеотидных шагом. Универсальный связывания праймера фланге сайтов каждой стороны окна.

В. Обобщение Array. Плиточные заказов олиго должны быть представлены Agilent, где последовательности будут напечатаны на пользовательские микрочипов олигонуклеотида.

С. Совместная иммунопреципитации. После кипячения олигонуклеотидов с массивом, инкубировать в HeLa ядерный экстракт, затем добавить экстракт магнитных шариков, которые готовятся с антителами против RNP интересов. Этикетка начиная олиго бассейн с Cy3 и связаны IP бассейн с Cy5 и применить к массиву обнаружения и сканирования.

Рисунок 2. Аннотирование геном и анализ обогащения данных.

А. Преобразование средний балл в каждой геномной координировать из массива данных на базе десяти журнал и карту, счет до заданным координатам. Иллюстрацией такого усреднения шаг дается на 3 перекрытие 30-п олигонуклеотидов с множеством 2, 4 и 0,5, где средняя оценка обогащения для каждого 10-п окно на графике выше. Отдельных регионах генома могут быть визуализированы с помощью пользовательских трека в браузере Геном USCS. Например окна браузера в данном гене clta, где ген особенности (экзонов / интроны / альтернативного сплайсинга и др.) даются по дну и журналов средний балл обогащения ПТБ-связанной олигонуклеотидов представлены темно-красные вертикальные полосы. PTB сильно связывает чуть выше по течению экзона 2 в полипиримидиновых-кишечного тракта.

Discussion

При выполнении этой процедуры его важно помнить, что создание пула гибкими и открытыми для модификации либо на РНК или белка. На уровне РНК ортологичных регионах, болезнь мутаций, полиморфизмов, или случайные мутации могут быть введены в олигонуклеотидные последовательности. На уровне белка РНК-связывающего фактора может быть изменен путем фосфорилирования или другую должность поступательные изменения. Кроме того, обязательным среды можно управлять, чтобы увеличить или уменьшить уровни дополнительные факторы, которые взаимодействуют или конкурировать с РНК-связывающий белок, представляющих интерес.