Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP's) op de menselijke pre-mRNA

Summary

Vanwege het tijdelijke karakter van de pre-mRNA, kan het moeilijk zijn te isoleren en te bestuderen<em> In vivo</em>. Hier presenteren wij een nieuwe<em> In vitro</em> Benadering van de RNA-eiwit interacties met behulp van een synthetische oligo pool te onderzoeken die tegels in geselecteerde regio's van de pre-mRNA.

Abstract

Sequencing RNA dat co-immunoprecipitaat (co-IP) met RNA-bindende eiwitten is ons begrip van splicing verhoogd door aan te tonen dat de binding locatie vaak invloeden functie van een splicing factor. Echter, zoals met alle monsters de strategie van de kans op het identificeren van een RNA gebonden aan een splicing factor is evenredig aan zijn cellulaire overvloed. We hebben een nieuwe in vitro benadering voor landmetingen bindingsspecificiteit anders is van voorbijgaande aard pre-mRNA. Deze aanpak maakt gebruik van een speciaal ontworpen oligonucleotide zwembad dat tegels in introns, exons, splitsen knooppunten of andere pre-mRNA. Het zwembad wordt onderworpen aan een soort van moleculaire selectie. Hier tonen we de methode van het scheiden van de oligonucleotide in een gebonden en ongebonden fractie en gebruik maken van een twee kleuren reeks strategie om de verrijking van elke oligonucleotide record in de gebonden fractie. De array data genereert hoge resolutie kaarten met de mogelijkheid om te identificeren sequentie-specifieke en structurele determinates van ribonucleoproteïne (RNP) bindend voor pre-mRNA. Een uniek voordeel van deze methode is de mogelijkheid om de bemonstering voorkeur voor mRNA geassocieerd met de huidige IP-en SELEX technieken te vermijden, zoals het zwembad is speciaal ontworpen en gesynthetiseerd uit de pre-mRNA-sequentie. De flexibiliteit van de oligonucleotide zwembad is een ander voordeel, omdat de onderzoeker kiest welke regio's om te studeren en tegels breed, op maat van het zwembad aan hun individuele behoeften. Met behulp van deze techniek kan men assay de effecten van polymorfismen of mutaties op binding op grote schaal of kloon van de bibliotheek in een functioneel splicing verslaggever en identificeren oligonucleotiden die verrijkt zijn met de meegeleverde fractie. Deze nieuwe in vitro met een hoge resolutie in kaart brengen regeling voorziet in een unieke manier om RNP interacties met tijdelijke pre-mRNA soorten, waarvan de lage overvloed maakt ze moeilijk te bestuderen met de huidige in-vivo-technieken te bestuderen.

Protocol

Pool ontwerp en oligo herstel De eerste stap is om de pre-mRNA pool ontwerp te bestuderen. Dit kan worden gedaan met behulp van de UCSC Genome Browser en het downloaden van bepaalde genen, splits knooppunten, of andere gebieden van belang. Zodra de ramen van belang zijn geselecteerd, tegel over hen computationeel met behulp van de volgende voorwaarden: lees de lengte moet 30 nucleotiden met een 10 nucleotide overlap, dus elke oligo is verschoven 20 nucleotiden van de voorafgaande een. * Oligo overla…

Discussion

Bij het doen van deze procedure zijn belangrijk te weten dat oprichting van de pool herinneren is flexibel en dus vatbaar voor wijzigingen op een van beide het RNA of eiwit niveau. Op het RNA-niveau orthologe regio's, de ziekte van mutaties, polymorfismen, of willekeurige mutaties kunnen worden geïntroduceerd in de oligonucleotide sequentie. Op het eiwitgehalte van de RNA-bindende factor kan gewijzigd worden door fosforylering of andere post-translationele modificaties. Bovendien kan de binding omgeving worden gema…