Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos
Summary
Devido à natureza transitória do pré-mRNA, pode ser difícil isolar e estudar<em> In vivo</em>. Aqui, apresentamos um romance<em> In vitro</em> Abordagem para investigar interações RNA-proteína usando um pool oligo sintéticos que as telhas em regiões selecionadas de pré-mRNA.
Abstract
Seqüenciamento RNAs que co-immunoprecipitate (co-IP) com proteínas de ligação RNA tem aumentado nossa compreensão de splicing, demonstrando que a localização de ligação, muitas vezes influencia a função de um fator de splicing. No entanto, como em qualquer estratégia de amostragem a chance de identificar um RNA ligado a um fator de splicing é proporcional à sua abundância celular. Nós desenvolvemos um romance abordagem in vitro para o levantamento especificidade de ligação de outra forma transitória pré-mRNA. Esta abordagem utiliza uma piscina projetada especificamente oligonucleotídeo que as telhas em introns, exons, junções de emenda ou outros pré-mRNA. A piscina é submetido a algum tipo de seleção molecular. Aqui, nós demonstrar o método, separando o oligonucleotídeo em uma fração associados e não associados e utilizar uma estratégia de duas variedade de cores para gravar o enriquecimento de cada oligonucleotídeo na fração ligada. Os dados de matriz gera mapas de alta resolução com a capacidade de identificar sequências específicas e estruturais determinantes da ribonucleoproteína (RNP) obrigatórias para pré-mRNA. A única vantagem deste método é a sua capacidade para evitar o viés de amostragem para mRNA associado IP atual e técnicas SELEX, como a piscina foi especificamente projetado e sintetizado a partir do mRNA de pré-seqüência. A flexibilidade da piscina oligonucleotídeo é outra vantagem desde o experimentador escolhe quais as regiões para estudar e telha de diâmetro, adaptando a piscina para as suas necessidades individuais. Usando esta técnica, pode-se ensaio os efeitos de polimorfismos ou mutações na ligação em grande escala ou clone da biblioteca em um repórter de emenda funcional e identificar oligonucleotídeos que são enriquecidos na fração incluídos. Este romance in vitro de alta resolução esquema de mapeamento fornece uma forma única para estudar as interações RNP com transiente pré-mRNA espécies, cuja baixa abundância que torna difícil o estudo com atual em técnicas vivo.
Protocol
Discussion
Ao fazer este procedimento é importante lembrar que a criação da piscina é flexível e aberto a modificações em uma ou outra o RNA ou o nível de proteína. No nível de RNA regiões ortólogos, mutações doença, polimorfismos ou mutações aleatórias podem ser introduzidos na seqüência de oligonucleotídeos. No nível de proteína do fator de ligação RNA podem ser modificados por fosforilação ou modificações pós-translacionais outros. Além disso, o ambiente de ligação pode ser manipulado para aumen…
