İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)
Summary
Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor olabilir<em> In vivo</em>. Burada, bir roman mevcut<em> In vitro</em> Yaklaşım, sentetik bir oligo havuzu kullanarak RNA-protein etkileşimleri araştırmak için pre-mRNA seçilen bölgelerde fayans.
Abstract
RNA'lar Sıralama RNA bağlayıcı proteinler ile birlikte immunoprecipitate (co-IP), bu bağlayıcı konuma göstererek ekleme anlayışımız artan sıklıkla bir ekleme faktörü fonksiyonu etkiler. Ancak, herhangi bir örnekleme stratejisi ile bir ekleme faktörüne bağlı bir RNA belirleme şansı hücresel bolluk orantılıdır. Biz aksi takdirde geçici pre-mRNA bağlayıcı özgüllüğü araştırmak için bir roman in vitro yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım, özel olarak tasarlanmış bir oligonükleotid havuzu kullanan intronlar, ekzon, ek kavşaklar, veya diğer pre-mRNA boyunca fayans. Havuz, bir tür moleküler seçim tabi tutulur. Burada, ilişkili ve ilişkisiz bir bölümünü içine oligonükleotid ayırarak yöntem göstermek ve bağlı fraksiyon her oligonükleotid zenginleştirme kaydetmek için bir iki renk dizisi stratejisi kullanacaklardır. Dizi veri dizisi özel ve yapısal pre-mRNA bağlayıcı ribonükleoprotein (RNP) determinates tanımlamak için yeteneği ile yüksek çözünürlüklü haritalar üretir. Bu yöntem için eşsiz bir avantajı havuz özellikle pre-mRNA dizisi tasarlanmış ve sentezlenmiş olarak, mevcut IP ve SELEX teknikleri ile ilgili mRNA doğru örnekleme yanlılığı önlemek için yeteneğidir. Deneyci, havuzu kendi ihtiyaçlarına uyarlayarak çapında çalışma ve kiremit hangi bölgeleri seçer oligonükleotid havuzu esneklik başka bir avantajdır. Bu tekniği kullanarak, bir tahlil büyük bir ölçekte bağlayıcı veya fonksiyonel bir ekleme muhabiri kütüphane klon ve fraksiyonunda zenginleştirilmiş olduğunu oligonükleotidler tespit polimorfizmleri veya mutasyonların etkileri. In vitro yüksek çözünürlüklü eşleştirme düzenini Bu roman düşük bolluk in vivo teknikler mevcut çalışma zorlaştırır geçici pre-mRNA türleri, RNP etkileşimleri çalışmak için benzersiz bir şekilde sağlar.
Protocol
Discussion
RNA veya protein düzeyi ya havuz bu yaratılış hatırlamak için bu yordamı bu çok önemli yaparken esnek ve modifikasyon açık. RNA düzeyinde orthologous bölgelerde, hastalık mutasyonlar, polimorfizmleri, ya da rastgele mutasyonların oligonükleotid dizisi içine sokulabilir. RNA bağlayıcı faktör protein düzeyinde fosforilasyon veya diğer post translasyonel modifikasyonlar tarafından değiştirilebilir. Ayrıca, bağlayıcı bir ortamda ya ek faktörlerin etkileşim veya ilgi RNA bağlayıcı protein i…
