Summary
हम निर्धारण एम्बेडिंग के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन है, सेक्शनिंग, और देर चरण के इमेजिंग
Abstract
के morphogenesis
Protocol
- एक लगानेवाला एक 20 मिलीलीटर कांच जगमगाहट शीशी में 50mm Cacodylate बफर में 12.5% Glutaraldehyde (pH7.4) युक्त समाधान के हौसले 2ml तैयार. N - हेपटैन 8ml जोड़ें और सख्ती से हिला. दो चरणों को अलग करने की अनुमति दें. एक साफ जगमगाहट शीशी में ऊपरी n-हेपटैन glutaraldehyde के साथ संतृप्त युक्त चरण, जगह निकालें और अलग निर्धारित करें. यह लगानेवाला समाधान हो जाएगा.
- 0-20 घंटे एक भ्रूण संग्रह कक्ष है, जो एक हटाने योग्य जाल डालने के साथ एक छोटी टोकरी का उपयोग कर भ्रूण लीजिए. 2-3 मिनट के लिए एक 50% ब्लीच समाधान में भ्रूण भिगोने द्वारा बाहरी chorion झिल्ली निकालें, या जब तक भ्रूण ब्लीच की सतह के लिए नाव. एक कागज तौलिया पर ddH20 और दाग भ्रूण के साथ अच्छी तरह कुल्ला.
- संदंश का प्रयोग, जाल डालने जो dechorionated लगानेवाला समाधान में भ्रूण और जगह के साथ कवर किया जाता है, भ्रूण जाल से गिर करने के लिए अनुमति लेने. भ्रूण 1.5 घंटे के लिए 4 में ठीक करने के लिए ° सी, जबकि एक Nutator पर मिश्रण की अनुमति दें.
- एक पेट्री डबल पक्षीय टेप के साथ पंक्तिवाला पकवान तैयार है. एक पाश्चर pipet का उपयोग लगानेवाला से भ्रूण निकालें और उन्हें पेट्री dish.Transfer के टेप सतह लगानेवाला समाधान की एक न्यूनतम राशि में भ्रूण पर जगह टेप की गोंद भंग से लगानेवाला में हेपटैन को रोकने. पेट्री डिश हिलाएँ भ्रूण की एक परत बनाने के लिए. हेपटैन evaporates जब तक हुड में पेट्री डिश रखें. पर्याप्त पीबीएस 0.1 +% Tween20 जोड़ें भ्रूण को कवर. हाथ devitellinize एक कुंद टंगस्टन सुई के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत देर से मंच 16 भ्रूण. एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में पाश्चर pipet के साथ भ्रूण पुनर्प्राप्त. 5-7 कदम इस microfuge ट्यूब में बाहर किया जाता है.
- 0.1M Cacodylate बफर, 7.4 पीएच में भ्रूण कुल्ला और फिर और एक 1% 0.1M Cacodylate बफर, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 7.4 पीएच में आज़मियम tetroxide समाधान युक्त में पोस्ट - ठीक है. 0.1M Cacodylate बफर, 7.4 पीएच के साथ भ्रूण कुल्ला.
- इथेनॉल और एसीटोन की एक वर्गीकृत श्रृंखला में भ्रूण निर्जलीकरण. निर्जलीकरण, 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल द्वारा बाद 10 मिनट के लिए 50% इथेनॉल के साथ भ्रूण. फिर 10 मिनट और 10 मिनट प्रत्येक के दो 100% एसीटोन कदम के लिए 90% एसीटोन में निर्जलीकरण.
- एसीटोन निकालें और फिर एक 1:1 EPON-Spurr राल जोड़कर घुसपैठ की प्रक्रिया शुरू: भ्रूण एसीटोन मिश्रण. तीन एक Pelco Biowave प्रो माइक्रोवेव का उपयोग जबकि वैक्यूम दबाव के तहत नमूना रखने मिनट के लिए माइक्रोवेव. एक अतिरिक्त पाँच मिनट बाद माइक्रोवेव समाप्त हो गया है के लिए वैक्यूम नमूना करने के लिए दबाव लागू करें. विनिमय 01:01 राल, 100% राल EPON Spurr और माइक्रोवेव के साथ वैक्यूम दबाव के तहत एक बार फिर एसीटोन मिश्रण. एक्सचेंज 100% EPON-Spurr राल अंतिम समय, वैक्यूम दबाव के तहत और माइक्रोवेव.
- एक पाश्चर pipet का प्रयोग, भ्रूण microfuge ट्यूब से एक सिलिकॉन एम्बेडिंग मोल्ड करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. भ्रूण को एक ऐसी है कि भ्रूण के पीछे अंत आचारण के पतला बढ़त के साथ aligns पंक्ति में संरेखित करें. एक रातोंरात ° सी ओवन 70 में बनाओ.
- नमूना निकालें और सेक्शनिंग के लिए तैयार हैं.
- 1μm डायमंड histo चाकू और Richert Ultracut ई सूक्ष्म तक्षणी वर्गों का उपयोग कर काटने शुरू करो. जब पहली भ्रूण अनुभाग तक पहुँच जाता है ध्यान रखना. इस बिंदु से, नमूना में 100μm काटा. एक पाश का उपयोग कर खंड निकालें, और एक गिलास स्लाइड पर जगह. संक्षेप में गर्मी एक गर्म थाली पर अनुभाग. Methylene ब्लू की एक बूंद का उपयोग अनुभाग दाग. एक रोशनी खुर्दबीन के तहत दिल लुमेन की पहचान.
- 90nm वर्गों का उपयोग कर एक डायमंड अल्ट्रा 45 ° चाकू और Richert Ultracut ई सूक्ष्म तक्षणी कट. एक तांबे ग्रिड पर एकाधिक अनुभागों उठाओ.
- ग्रिड 3% uranyl दस मिनट के लिए 50% इथेनॉल में संतृप्त एसीटेट के साथ दाग रहे हैं और फिर दोहरा आसुत जल में तीन बार से rinsed. फिर, ग्रिड 2.5 मिनट के लिए नेतृत्व (10ml दोहरा आसुत जल और 100ml 10M NaOH में भंग 0.04gms) NaOH छर्रों से युक्त करने के लिए सीओ 2 मुक्त वातावरण बनाने के चैम्बर में साइट्रेट के साथ दाग रहे हैं. ग्रिड दोहरा आसुत जल में तीन बार rinsed हैं.
- धारा 80Kv पर एक JEOL 1200EX इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ जांच कर रहे हैं, और एक AMT डिजिटल कैमरा के साथ फोटो खिंचवाने.
Discussion
ड्रोसोफिला भ्रूण दिल ट्यूब के morphogenesis भ्रूण विकास के दौरान कोशिका आसंजन और सेल के आकार में परिवर्तन के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है. इस संरचना का अध्ययन करने में चुनौतियों का सामना करना पड़ा है कि दिल की ट्यूब के लुमेन पूरे माउंट भ्रूण में कल्पना करना मुश्किल है. इस वीडियो में प्रदर्शन तकनीक है, जो पहले वर्णित प्रक्रियाओं 1-2 से रूपांतरित किया गया था करने के लिए कुशलतापूर्वक और मज़बूती से दिल ट्यूब और लुमेन 3 गठन के लिए जीनोटाइप का एक पर्याप्त संख्या का विश्लेषण करने में सफल साबित हुई है.
Acknowledgments
दिल ट्यूब गठन पर हमारा काम एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान पुरस्कार (0744165 आईडी) के द्वारा SGK समर्थित किया गया
References
- Tepass, U., Hartenstein, V. The Development of Cellular Junctions in the Drosophila embryo. Dev. Biol. 161, 563-596 (1994).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, S. Drosophila Protocols. , (2000).
- Santiago-Martinez, E., Soplop, N. H., Patel, R., Kramer, S. G. Repulsion by Slit and Roundabout prevents Shotgun/E-cadherin-mediated cell adhesion during Drosophila heart tube lumen formation. J. Cell Biol. 182, 241-248 (2008).
