电子显微镜对胚胎的制备果蝇胚胎心管

Summary

我们描述了一个固定，包埋过程，切片，和后期成像

Abstract

的形态发生

Protocol

1. 刚准备一个含有20毫升的玻璃闪烁瓶12.5％戊二醛在50MM Cacodylate缓冲液（pH7.4）固定液的解决方案2毫升。加入正庚烷8毫升大力动摇。允许分开的两个阶段。到一个干净的闪烁瓶中取出上相含戊二醛饱和的正庚烷，地点和预留。这将是固定液。
2. 收集0-20小时的胚胎，利用胚胎收集室，这是一个可移动的网格插入的小篮子。 50％的漂白粉溶液中浸泡2-3分钟胚胎取出的外蛋壳膜，或直到胚​​胎浮到表面的漂白剂。彻底冲洗用纸巾上ddH20和杂交胚胎。
3. 使用镊子，拿起覆盖dechorionated胚胎和成的固定液，使胚胎下降网格的网格插入。允许胚胎修正为1.5小时，在4 ° C，而在一个Nutator混合。
4. 准备一个培养皿内衬双面胶带。从固定液使用巴斯德吸管取出胚胎和他们放到录音的Petri dish.Transfer表面少量的胚胎在固定液固定液庚，以防止溶解的磁带的粘合剂。摇动培养皿中的胚胎单层。直到庚蒸发的防护罩放置在培养皿。加入足够的PBS + 0.1％Tween20到胚胎。手devitellinize后期阶段的16个胚胎解剖显微镜下用钝器钨针。恢复到1.5 ml离心管巴斯德吸管的胚胎。在此离心管进行步骤5-7。
5. 冲洗胚胎0.1M Cacodylate缓冲液，pH 7.4，然后在0.1M Cacodylate缓冲液，pH 7.4在室温下1小时，含1％四氧化锇溶液后修复。冲洗0.1M Cacodylate缓冲液，pH值7.4的胚胎。
6. 在乙醇和丙酮梯度脱水胚胎。胚胎脱水用50％乙醇10分钟，70％乙醇10分钟。然后在90％丙酮脱水10分钟，和两个100％丙酮，每次10分钟的步骤。
7. 删除丙酮，然后开始加入1:1的EPON Spurr树脂渗透的过程：丙酮混合胚胎。微波三分钟使用Pelco的功能弹性临微波真空压力下，同时保持样品。申请一个额外的5分钟后，已经结束的微波真空压力的样品。交易所1:1树脂，丙酮100％EPON - Spurr树脂和微波真空压力下。交易所的100％EPON - Spurr树脂最后的时间，和微波真空压力下。
8. 使用巴斯德吸管，胚胎转移的离心管，以硅树脂嵌入模具。成一排，这样的胚胎后结束与模具的锥形边缘对齐，对齐胚胎。烘烤在70 ° C烘箱过夜。
9. 取出样品，准备切片。
10. 开始切割1μm的部分，用金刚石HISTO刀和里克特Ultracut发送切片。请注意，当第一个胚胎部分达到。从这一点来说，削减100μm的进样。删除部分使用循环，并到载玻片的地方。简要地热的一个热点板块的部分。使用一滴亚甲蓝染色部分。在光学显微镜下识别心腔。
11. 切割使用90纳米钻石超45 °刀和里克特Ultracut发送切片部分。拿起一个铜栅上的多个部分。
12. 网格3％的铀，50％的乙醇10分钟饱和醋酸染色，然后在双蒸水冲洗三次。然后，电网染色柠檬酸铅中含有氢氧化钠颗粒创建一个CO _2，自由的环境室（中10毫升双蒸水和100ml 10M NaOH溶液溶解0.04gms）为2.5分钟。电网双蒸水冲洗三次。
13. 节用JEOL 1200EX电子显微镜检查，在80KV，AMT数码相机拍摄的。

Discussion

果蝇胚胎的心管的形态发生，已成为一个有价值的模型系统，为研究胚胎发育过程中的细胞粘附和细胞形态的变化。在研究这种结构所面临的挑战之一是，很难想象在整装胚胎的心管的管腔。在这个视频演示的技术，这是从前面描述的程序^1-2适应，已被证明是有效和可靠地分析大量的基因型心管和管腔形成³的成功。