Summary
우리는 sectioning, 고정, 삽입을위한 과정을 설명하고, 늦은 단계의 이미지
Abstract
의 morphogenesis
Protocol
- 갓 20 ML 유리 섬광 병에 50mM Cacodylate 버퍼에서 12.5 %의 글루 타 알데히드 (pH7.4)를 포함하는 정착액 솔루션 2ml 준비합니다. N - 헵탄의 8ml를 추가하고 적극적으로 발라줍니다. 두 단계로 분리 수 있습니다. 깨끗한 섬광의 약병에 N - 헵탄 글루 타 알데히드와 채도를 포함하는 상위 단계, 장소를 제거하고 따로 설정합니다. 이것은 고정력있는 솔루션이 될 것입니다.
- 이동식 메쉬 삽입과 작은 바구니는 배아 수집 챔버를 사용 00~20시간의 배아를 수집합니다. 2-3분의 50 % 표백 용액에 배아를 담글하여 외부 chorion 막 제거 또는 태아는 표백제의 표면에 떠까지. 종이 타월에 ddH20와 얼룩 배아로 철저히 씻어.
- 포셉를 사용하여 태아의 메쉬에서 가을 있도록 정착액 솔루션으로 dechorionated 배아과 장소로 덮여 있습니다 메쉬 삽입을 선택합니다. 배아 4 1.5 시간 고칠 ° C를 Nutator에 혼합하는 동안 허용합니다.
- 양면 테이프로 늘어선 페트리 접시를 준비합니다. 파스퇴르 pipet을 사용하여 정착액에서 배아를 제거하고 테이프의 접착제를 해소에서 정착액의 헵탄을 방지하기 위해 페트리 dish.Transfer의 녹화 표면 정착액 솔루션의 최소한의 배아에 그들을 놓으십시오. 배아의 단일 레이어를 만들기 위해 페트리 접시를 흔들어. 헵탄 증발 때까지 후드의 페트리 접시를 놓습니다. 배아를 커버하기에 충분한 PBS + 0.1 % Tween20를 추가합니다. 뭉툭한 텅스텐 바늘로 해부 현미경으로 직접 devitellinize 후반 16 단계 배아. 1.5 ML의 microfuge 관에 파스퇴르 pipet와 배아를 복구할 수 있습니다. 5-7 단계는이 microfuge 관에서 실시하고 있습니다.
- 0.1M Cacodylate 버퍼, pH를 7.4에서 배아를 씻어 후 0.1M Cacodylate 버퍼, 실온에서 1 시간 동안 산도를 7.4에서 1 % 오스뮴의 tetroxide을 포함하는 용액에 포스트 수정. 0.1M Cacodylate 버퍼, pH를 7.4로 배아를 씻어.
- 에탄올과 아세톤의 등급 일련의 배아를 탈수. 10 분 70 % 에탄올 다음 10 분 동안 50 %의 에탄올과 배아를 탈수. 그런 다음 10 분 10 분 각각의 두 100 % 아세톤 단계 90 %의 아세톤으로 탈수.
- 아세톤을 제거한 다음 1:1 Epon - 스퍼 수지 추가하여 침투 과정을 시작 : 배아에 아세톤 혼합합니다. 진공 압력 아래 샘플을 유지하면서 Pelco Biowave 프로 전자 레인지를 사용하여 3 분 전자렌지. 전자 레인지가 끝난 후 추가로 5 분 동안 샘플로 진공 압력을 적용합니다. 교환 1:1 수지 100 % Epon - 스퍼 수지와 전자렌지로 다시 진공 압력 하에서 아세톤 혼합물. 진공 압력 하에서 교환 100 % Epon - 스퍼 수지 최종 시간, 전자렌지.
- 파스퇴르 pipet 사용 배아는 실리콘 포함 금형에 microfuge 튜브에서 전송됩니다. 배아의 사후 끝이 금형의 테이퍼 가장자리와 일치 그러한 행을으로 배아를 맞춥니다. 70 ° C 오븐에 구워 하룻밤.
- 샘플을 제거하고 sectioning 준비.
- 다이아몬드 조직을 나이프와 리처트 Ultracut E 마이크로톰를 사용하여 1μm 섹션을 절단 시작합니다. 최초의 배아 부분에 도달하면 기록해 둡니다. 이 시점에서 샘플로 100μm 했네요. 루프를 사용하여 섹션을 제거하고 유리 슬라이드에 놓습니다. 간단히 뜨거운 접시에 섹션을 가열. 메틸렌 블루의 드롭을 사용하여 섹션을 얼룩. 가벼운 현미경 심장 루멘를 확인합니다.
- 다이아몬드 울트라 45 ° 나이프와 리처트 Ultracut E 마이크로톰를 사용하여 90nm 부분을 잘라. 구리 격자에 여러 섹션을 선택하십시오.
- 격자 10 분 50 % 에탄올에 포화 3 % uranyl 아세테이트 물들일 후 두 번 증류수로 세 번 씻어서 있습니다. 그런 다음 그리드 2 - 무료 환경 CO를 만들 수 NaOH 알약이 들어있는 챔버에 2.5 분 리드 구연 산염 (10ml 더블 증류수와 100ml 10M NaOH에 용해 0.04gms) 물들일 수 있습니다. 격자는 두 번 증류수로 세 번 씻어서 있습니다.
- 섹션은 80Kv에서 JEOL 1200EX 전자 현미경으로 검사하고, AMT 디지털 카메라로 촬영하고 있습니다.
Discussion
Drosophila 태아의 심장 관의 morphogenesis는 배아 발달 동안 세포 접착과 세포 모양의 변화를 공부에 유용한 모델 시스템으로 등장하고 있습니다. 이 구조를 공부에 직면한 도전 과제 중 하나는 심장 튜브의 루멘 전체가 탑재 배아의 시각화하기 어려운 것입니다. 이전에 설명한 절차 1-2에서 적응되었다이 비디오에서 보여준 기술은, 효율적이고 안정적으로 심장 튜브 및 루멘 형성 3 genotypes의 상당한 수를 분석에서 성공 입증했다.
Acknowledgments
심장 튜브 형성에 우리 작품 SGK에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 그랜트 (수상 ID 0744165)에 의해 지원되었다
References
- Tepass, U., Hartenstein, V. The Development of Cellular Junctions in the Drosophila embryo. Dev. Biol. 161, 563-596 (1994).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, S. Drosophila Protocols. , (2000).
- Santiago-Martinez, E., Soplop, N. H., Patel, R., Kramer, S. G. Repulsion by Slit and Roundabout prevents Shotgun/E-cadherin-mediated cell adhesion during Drosophila heart tube lumen formation. J. Cell Biol. 182, 241-248 (2008).
