Summary
Мы опишем процесс фиксации, вложения, секционирования и визуализация поздней стадии
Abstract
Морфогенез
Protocol
- Недавно подготовить 2 мл фиксирующего раствора, содержащего 12,5% глутарового альдегида в 50 мМ буфере какодилатном (pH7.4) в 20 мл флакон сцинтилляционных стекла. Добавить 8 мл н-гептана и энергично встряхивают. Разрешить два этапа, чтобы отделиться. Удаление верхней фазы, содержащей н-гептана насыщенный глутаральдегида, место в чистый флакон сцинтилляционных и отложите. Это будет фиксирующий раствор.
- Сбор эмбрионов 0-20 час, используя камеру эмбриона коллекции, которая небольшую корзинку со съемной вставки сетки. Удалите внешнюю мембрану хориона путем замачивания эмбрионов в 50% раствор хлорки в течение 2-3 минут, или пока эмбрионов всплывают на поверхность отбеливателем. Тщательно промойте и промокните ddH20 эмбрионов на бумажное полотенце.
- Использование щипцов, подобрать сетку вставить которая покрыта dechorionated эмбрионов и поместить в фиксатор решение, позволяющее эмбрионов падать из сетки. Разрешить эмбрионов исправить в течение 1,5 часа при температуре 4 ° С при перемешивании на Nutator.
- Подготовка чашку Петри выстроились с двухсторонней ленты. Удалить эмбрионов из фиксатора использованием пипетки Пастера и разместить их на пленку поверхности Петри dish.Transfer эмбрионов в минимальном количестве фиксирующий решение, чтобы избежать гептана в фиксатор от растворения клея ленты. Встряхните чашке Петри, чтобы один слой эмбрионов. Место чашки Петри в капот, пока гептан испаряется. Добавьте достаточно PBS + 0,1% Tween20 для покрытия эмбрионов. Ручной devitellinize поздней стадии 16 эмбрионов при вскрытии микроскоп с тупой иглой вольфрама. Восстановление эмбрионы с пипеткой Пастера в 1,5 трубки микроцентрифужную мл. Шаги 5-7 выполняются в этом микроцентрифужную трубки.
- Промойте эмбрионы в 0,1 М какодилатном буфере, рН 7,4, а затем после исправления в растворе, содержащем 1% осмия в 0,1 М какодилатном буфере, рН 7,4 в течение 1 часа при комнатной температуре. Промыть эмбрионы с 0,1 какодилатном буфере, рН 7,4.
- Дегидрировать эмбрионов в градуированных серии этанола и ацетона. Дегидрировать эмбрионов с 50% этанола в течение 10 минут, затем 70% этанолом в течение 10 минут. Затем обезвоживают в 90% ацетоном в течение 10 минут, а два 100%-ным ацетоном с шагом 10 минут каждый.
- Удалить ацетоном, а затем начать процесс инфильтрации, добавив 1:01 Epon-Сперр смолы: ацетон, чтобы эмбрионы. Микроволновые в течение трех минут с помощью Pelco Biowave Pro микроволновой сохраняя при этом образце под вакуумным давлением. Применение вакуумного давления на образец еще на пять минут после микроволновой закончилась. Биржа смолы 1:1, ацетон со 100%-Epon Сперр смолы и СВЧ снова под вакуумным давлением. Бирже 100% Epon-Сперр смолы последний раз, и микроволновая печь под вакуумным давлением.
- С помощью пипетки Пастера, эмбрионы переносятся с микроцентрифужную трубки плесень вложение силикона. Совместите эмбрионов в ряд так, что задний конец эмбриона совпадет с коническим краем формы. Выпекать в 70 ° С духовку на ночь.
- Удалить образец и подготовиться к секционирования.
- Начало резки 1 мкм разделы, используя Алмазный историка нож и Richert Ultracut E Микротом. Принять к сведению, когда первая часть эмбриона будет достигнута. С этой точки, вырезать 100 мкм в образце. Удалить раздел с помощью цикла, и место на предметное стекло. Кратко тепла раздел на горячей плите. Пятно секции, используя капли метиленового синего. Под световым микроскопом идентифицировать сердце просвет.
- Вырезать 90-нм разделы, используя Алмазный Ультра 45 ° нож и Richert Ultracut E Микротом. Возьмите несколько разделов на медную сетку.
- Решетки окрашивали 3% уранилацетата насыщенным в 50% этаноле в течение десяти минут, а затем промыть три раза в бидистиллированной воде. Затем, сетки окрашивали цитратом свинца (0.04gms растворенного в 10 мл бидистиллированной воды и 100 мл 10М NaOH) в течение 2,5 минут в камеру, содержащую гранулы NaOH для создания СО 2-среды, свободной. Сетки промыть три раза в бидистиллированной воде.
- Разделы, рассматривались с JEOL 1200EX электронного микроскопа в 80Kv, а также сфотографироваться с камеры AMT цифровой.
Discussion
Морфогенез сердца трубка дрозофилы эмбриональных стала ценным модельной системой для изучения клеточной адгезии и изменения формы клеток в процессе эмбрионального развития. Одна из проблем, возникающих в изучение этой структуры является то, что просвет трубки сердца трудно представить себе в целом эмбрионов монтирования. Техника показала в этом видео, которое было взято из ранее описанных процедур 1-2, оказалась успешной в эффективном и надежном анализе значительного числа генотипов для трубки сердца и просвета формирование 3.
Acknowledgments
Наша работа по формирования сердца трубка была поддержана Национальным научным фондом Грант (премия ID 0744165) в СГК
References
- Tepass, U., Hartenstein, V. The Development of Cellular Junctions in the Drosophila embryo. Dev. Biol. 161, 563-596 (1994).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, S. Drosophila Protocols. , (2000).
- Santiago-Martinez, E., Soplop, N. H., Patel, R., Kramer, S. G. Repulsion by Slit and Roundabout prevents Shotgun/E-cadherin-mediated cell adhesion during Drosophila heart tube lumen formation. J. Cell Biol. 182, 241-248 (2008).
