Aqui nós mostramos como fazer retro-orbital injeção em peixe-zebra adulto.
Abstract
Tratamento medicamentoso de animais inteiros é uma ferramenta essencial em qualquer sistema modelo para farmacológicos e químicos estudos genéticos. Injecção intravenosa (IV) é muitas vezes a forma mais eficaz e não invasivo de transporte de um agente de interesse. No peixe-zebra (<em> Danio rerio</em>), IV injeção de drogas tem sido um desafio, porque o diâmetro dos pequenos vasos. Esta também se mostrou um obstáculo significativo para a injeção de células durante o transplante de células-tronco hematopoética. Historicamente, as injeções para a corrente sanguínea foram feitas diretamente através do coração. No entanto, este procedimento intra-cardíaca tem uma taxa de mortalidade muito elevada como o coração é freqüentemente furado durante a injeção de deixar o peixe propensos à infecção perda de sangue, maciça ou lesão de órgão fatal. Com base na nossa experiência com o mouse, temos desenvolvido um procedimento de injeção novo no zebrafish em que o local da injeção é atrás do olho e no seio venoso retro-orbital. Este retro-orbital técnica de injeção (RO) tem sido empregada com sucesso em ambos injeção de drogas nos peixes adultos, bem como o transplante de células da medula todo rim. Injeção RO tem uma taxa de mortalidade muito menor do que a injeção intra-cardíaca tradicional. Peixes que são injetados retro-orbital tendem a sangrar a injeção menos seguinte e estão em um risco muito menor de lesão de um órgão importante como o coração. Células Além disso, quando realizado adequadamente, injetado e / ou drogas entrar rapidamente na corrente sangüínea permitindo compostos para exercer seu efeito sobre o peixe inteiro e células de rim facilmente o lar de seu nicho. Assim, esta técnica minimiza nova injeção de mortalidade, permitindo a entrega eficiente de material para a corrente sanguínea de peixes adultos. Aqui nós exemplificar essa técnica, retro-orbital injeção de Tg (<em> Globina</em>: GFP) em células adultas<em> Casper</em> Peixes, bem como a injeção de um corante fluorescente vermelho (dextran, Texas Red<em></em>) Em adultos<em> Casper</emPeixe>. Em seguida, visualize injeções de sucesso por microscopia de fluorescência toda animais.
Protocol
Parte 1. Preparação de material de injecção Tg (globina: GFP) células: Sangrar peixes doadores adultos usando ponteira 10ul revestido em heparina (1unit/ul) para pescar punção por trás de emalhar. Aspirar glóbulos vermelhos e dispensar em tampão celular (0.9x PBS + 5% de SFB + 1% Pen / Strep). Suspensão de células filtro sobre malha 40uM e determinar a concentração de células usando hemocitômetro como descrito por LeBlanc et al. Spin down e ress…
Discussion
Retro-orbital injeção em peixe-zebra adulto dá a maior eficiência de entrega de material injetado na corrente sanguínea com a menor incidência de mortalidade. Devido à natureza do local de injeção, a punção parece curar rapidamente, diminuindo a ocorrência de infecção e da quantidade de perda de sangue. O site pode até ser injetado repetidamente durante um curto período de tempo para injeções diárias de medicamentos, por exemplo.
Grandes quantidades de droga deve ser compr…
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado por Howard Hughes Medical Institute e uma concessão do NIH para o estudo da hematopoiese embrionária.
Materials
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Comment
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa