जेनेटिक inducible किस्मत मानचित्रण के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण: एक दृश्य गाइड मार्क और ट्रैक कक्ष Vivo में Published: December 30, 2009 doi: 10.3791/1687

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Ashly Brown¹, Stephen Brown², Debra Ellisor², Nellwyn Hagan¹, Elizabeth Normand¹, Mark Zervas²

¹Department of Neuroscience, Division of Biology and Medicine, Brown University, ²Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine, Brown University

Summary

जेनेटिक inducible किस्मत मानचित्रण (GIFM) के निशान और ठीक स्थानिक और लौकिक नियंत्रण के साथ पटरियों कोशिकाओं

Protocol

Tamoxifen तैयारी और मौखिक Gavage प्रक्रिया (E8.5)

• पूर्व गर्म मकई तेल में tamoxifen भंग करके एक 20 मिलीग्राम / एमएल tamoxifen के शेयर समाधान तैयार करें.
• 37 पर समाधान सेते ° सी के एक nutator और रहकर भंवर पर 2 घंटे के लिए.
• 4 में प्रकाश की दुकान, ° C से tamoxifen के शेयर को सुरक्षित रखें, और ऊपर के लिए एक महीने का उपयोग करने के लिए.
• और एक पुरुष दोनों एक जीन विशिष्ट CreER ^टी एलील और एक पत्रकार एलील ले; भाग्य मानचित्रण प्रयोगों के लिए, एक प्रजनन जोड़ी से मिलकर एक स्विस वेबस्टर (Taconic से खरीदा wildtype) महिला स्थापित. MGFP पुरुषों (2009 Ellisor), प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए, हम ^टी Wnt1 - CreER का उपयोग कर रहे हैं.
• स्विस वेबस्टर महिलाओं योनि प्लग की उपस्थिति के लिए हर सुबह की जाँच करें. नामित एक योनि प्लग 0.5 के बाद सहवास दिनों के रूप में देखा जाता है दिन की सुबह (0900) और इस आरंभिक बिंदु पर आधारित tamoxifen प्रशासन की तिथि की गणना. (इस प्रयोग के लिए, भ्रूण 8.5 दिन का इस्तेमाल किया गया था).
• एक पशु खिला सुई (20G 1-1/2 एक्स) के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करने के लिए tamoxifen के शेयर समाधान (4 मिलीग्राम tamoxifen) की 200 μl आकर्षित.
• मजबूती से गर्दन के डब लोभी करके समय गर्भवती स्विस वेबस्टर महिला नियंत्रित करना और वापस सिर को स्थिर करने के लिए और अधिक बारी तो उदर पक्ष का सामना करना पड़ रहा है.
• एक सीधी रेखा के शरीर में रखने मुक्त उंगलियों के बीच पूंछ पकड़ो.
• मुँह के कोने में खिला सुई प्लेस और धीरे से मुँह की छत के साथ सुई गाइड.
• सुई घुमाएँ इतना है कि यह शरीर के समानांतर है, जबकि एक साथ झुकाव सिर को पीछे से गर्दन रखने के लिए सीधे.
• घुटकी नीचे पेट की ओर सुई, गाइड. ट्रेकिआ में प्रवेश नहीं करने के लिए सावधान रहें. अगर वहाँ सुई, पशु ढकोसला पलटा संलग्न है, या अगर माउस संघर्ष, तुरंत सुई को हटाने और gavage फिर से कोशिश पर प्रतिरोध है.
• एक बार खिला सुई पेट में है, पेट में tamoxifen प्रशासन और विच्छेदन की तारीख तक उसे घर पिंजरे महिला वापसी.

Craniotomy:

• Intracardially perfuse वयस्क भाग्य पीएफए ​​4% के साथ माउस मैप और कैंची के साथ कंधे के ऊपर सिर्फ स्पाइनल कॉलम के माध्यम से काटने से सिर निकाल.
• सिर खोपड़ी के माध्यम से कटौती और खेना बेनकाब (व्याख्यान चबूतरे वाला दुम) के पृष्ठीय midline के साथ एक स्केलपेल चलाएँ.
• स्केलपेल का प्रयोग, दूर से और cranium के पक्ष और पीछे के साथ किसी भी अतिरिक्त ऊतक या मांसपेशियों परिमार्जन.
• संदंश, पंचर सिर्फ घ्राण बल्ब व्याख्यान चबूतरे वाला और एक छोटे से छेद बनाने के लिए ठीक कैंची के सुझावों को समायोजित midline पर खोपड़ी के साथ.
• इस छेद में ठीक कैंची डालें और पार्श्व लगभग घ्राण बल्ब की लंबाई के लिए औसत दर्जे का एक चीरा बनाते हैं. यह कटौती नाक की हड्डी और ललाट हड्डी के चौराहे पर खोपड़ी तोड़ने के लिए और कैंची के लिए अच्छी पहुँच प्रदान करेगा.
• खोपड़ी (पृष्ठीय midline) कैंची मस्तिष्क से दूर angled युक्तियाँ अंतर्निहित ऊतकों को नुकसान पहुँचाए से बचने रखना सुनिश्चित बनाने में बाण के समान sutures के साथ कट.
• संदंश के साथ धीरे और दूर छील हड्डी औसत दर्जे का चीरा साथ खोपड़ी मस्तिष्क बेनकाब समझ. खोपड़ी छोटे टुकड़ों में बंद चिप या बड़े वर्गों में दूर तोड़ सकता है. संदंश का उपयोग ललाट, पार्श्विका, interparietal, और पश्चकपाल हड्डियों के सभी हटायें जारी रखें.
• प्रत्येक पक्ष पर गोलाकार हड्डियों pinching द्वारा paraflocculi (सेरिबैलम के स्तर पर मस्तिष्क के पार्श्व किनारों के साथ स्थित) encasing हड्डियों क्रैक. धीरे दूर हड्डियों खींच.
• सिर उल्टा मुड़ें (पृष्ठीय नीचे की ओर) और संदंश का उपयोग कपाल नसों तोड़ और खोपड़ी से मस्तिष्क रिलीज.

पूरे पर्वत माइक्रोस्कोपी: वयस्क ब्रेन

• GFP अंकन के लिए वयस्क दिमाग एक फ्लोरोसेंट विदारक गुंजाइश का उपयोग कर का आकलन करें.
• एक पेट्री पकवान युक्त पीबीएस और तस्वीर PictureFrame या अन्य उचित सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क स्थानांतरण.

पूरे पर्वत माइक्रोस्कोपी: E12.5 भ्रूण

• GFP अंकन के लिए पूरे माउंट भ्रूण एक फ्लोरोसेंट विदारक गुंजाइश का उपयोग कर का आकलन करें.
• उन है कि एक पेट्री पकवान युक्त पीबीएस और तस्वीर PictureFrame या अन्य उचित सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए पूरे माउंट द्वारा सकारात्मक GFP हैं स्थानांतरण.
• संदंश का प्रयोग के लिए रवाना प्रत्येक भ्रूण से एक पूंछ का छोटा सा टुकड़ा चुटकी, एक पीसीआर ट्यूब में प्रत्येक टुकड़ा जगह है और दोनों alleles के लिए पीसीआर (2009 Ellisor) का उपयोग करने के लिए पूरे माउंट विश्लेषण के माध्यम से देखा परिणामों की पुष्टि ऊतक जीनोटाइप.

माइक्रो - विच्छेदन और उदर mesencephalon E12.5 भ्रूण से explant तैयारी

• गर्भाशय श्रृंखला और आईडी से विच्छेदन के बादभाग्य - मैप किए गए भ्रूण के पूरे माउंट प्रतिदीप्ति, एक सेल संस्कृति डिश में बर्फ ठंड बाँझ पीबीएस हस्तांतरण भ्रूण द्वारा entification.
• ठीक कैंची का प्रयोग, transversely काटने भ्रूण के सिर हिस्से rhombomere 1 करने के लिए दुम को हटा दें.
• अगला, diencephalon के माध्यम से एक राज्याभिषेक कटौती के साथ सिर के व्याख्यान चबूतरे वाला भाग को हटा दें. यह एक ट्यूब की तरह संरचना में जो mesencephalic पुटिका फार्म पृष्ठीय और उदर ऊतकों के बीच एक नाली के माध्यम से 4 वेंट्रिकल. खुलासा होगा
• ध्यान से 4 वेंट्रिकल, और पृष्ठीय midline साथ कटाव, व्याख्यान चबूतरे वाला करने के लिए दुम में कैंची सुझावों को सम्मिलित करते हैं, पूरी तरह से खोलने ट्यूब, एक "खुली किताब" तैयारी बनाने. उदर mesencephalon अब medially उजागर किया जाएगा, जबकि mesencephalon के दो पृष्ठीय आधा laterally निवास करेंगे.
• ऊतक और अधिक साफ रखना करने के लिए क्रम में उदर mesencephalon के नीचे किसी भी शेष गैर तंत्रिका ऊतक निकालें. यदि जरूरत हो, व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम जैसे कि explant के पृष्ठीय "पंख" फ्लैट के रूप में अच्छी तरह से देना होगा पहलुओं में notches के बनाते हैं. explant अब एक "तितली, जिसमें पृष्ठीय mesencephalon पंखों का प्रतिनिधित्व करता है और 1 पूंछ rhombomere सदृश चाहिए.
• आगे FACS विश्लेषण या सेल संस्कृति प्रयोगों के लिए उदर mesencephalon को अलग करने के लिए, पार्श्व ऊतक के (पृष्ठीय पहलुओं) को हटा दें.

प्रतिनिधि परिणाम:

इस GIFM प्रयोग में, Wnt1 व्यक्त कोशिकाओं स्थायी रूप से कर रहे हैं और heritably E8.5 में Wnt1 - CreERT tamoxifen प्रशासन द्वारा embryogenesis दौरान चिह्नित, mGFP भ्रूण. बाद में, इन चिह्नित कोशिकाओं पूरे माउंट प्रतिदीप्ति और अनुभाग immunohistochemistry निर्धारित करने के लिए कैसे Wnt1 - व्युत्पन्न कोशिकाओं के विकास भर में तंत्रिका संरचनाओं के लिए योगदान के माध्यम से कल्पना कर रहे हैं. पूरे माउंट प्रतिदीप्ति झिल्ली बाध्य mGFP रिपोर्टर के GFP घटक पर निर्भर करता है और इसलिए सेलुलर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Wnt1 व्युत्पन्न तंत्रिका अनुमानों के एक व्यापक दृष्टिकोण की जानकारी प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, E8.5, midbrain, पीछे hindbrain और रीढ़ की हड्डी (चित्रा 1 ए) में मुख्य रूप से E12.5 एक्ज़िबिट GFP प्रतिदीप्ति में Wnt1 CreERTmGFP भ्रूण पर tamoxifen प्रशासन के साथ. उच्च बढ़ाई है, ठीक है neuronal अनुमानों midbrain, दीवार शरीर, अंग, और craniofacial क्षेत्र innervating देखा जाता है. इस विकास के चरण में, भ्रूण पारदर्शी है और आंतरिक GFP लेबलिंग आसानी से discerned है. हालांकि, के रूप में मस्तिष्क का विकास, परिपक्व ऊतक के घनत्व GFP आंतरिक मस्तिष्क संरचनाओं से निकलती प्रतिदीप्ति obscures. इसलिए, E8.5 पर tamoxifen के प्रशासन के साथ, केवल मामूली GFP लेबलिंग पूरे माउंट प्रतिदीप्ति (चित्रा 1C, इनसेट) द्वारा वयस्क के बेहतर colliculi में मनाया जाता है. इसके अलावा, कुछ axonal अनुमानों hindbrain के ventral सतह के साथ दौड़ (नहीं दिखाया गया है) देखा जाता है. इसके विपरीत, जब tamoxifen E9.5 में प्रशासित किया जाता है, पर्याप्त GFP लेबलिंग पूरे अवर colliculi (चित्रा 1B, इनसेट) भर होता है. पूरे माउंट प्रतिदीप्ति में इस वृद्धि का संकेत हो सकता है कि Wnt1 व्यक्त E9.5 में कोशिकाओं पृष्ठीय midbrain के सतही क्षेत्रों को और अधिक महत्वपूर्ण योगदान इस क्षेत्र के भीतर या E8.5 से Wnt1 व्यक्त कोशिकाओं की तुलना में अधिक प्रक्रियाओं का विस्तार. बावजूद, पूरे माउंट प्रतिदीप्ति में इस अंतर को विकास के दौरान Wnt1 अभिव्यक्ति की गतिशील प्रकृति को दर्शाता है और यह दर्शाता है कि कैसे GIFM भ्रूण से परिपक्व वयस्क में अलग सेल आबादी का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Immunohistochemistry Wnt1 - CreERT से, भाग्य मैप किए गए ऊतक वर्गों के साथ, mGFP पशुओं सेलुलर स्तर पर विश्लेषण कर रहे हैं . Wnt1 वंश के ठीक पैमाने पर सेलुलर तंत्रिका संरचनाओं और सेल प्रकार के लिए योगदान निर्धारित GFP और β galactosidase (β - लड़की) के खिलाफ एंटीबॉडी ऊतक विशिष्ट biomarkers की एक किस्म के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किया जाता है. E8.5 tamoxifen प्रशासन और E12.5 ऊतक विश्लेषण के साथ, डबल सकारात्मक कोशिकाओं (GFP + और β - लड़की +) midbrain और उदर midbrain (चित्रा 1 बी) के माध्यम से दौड़ अनुमानों के साथ hindbrain भर में मनाया जाता है. वयस्क दिमाग में, E8.5 पर चिह्नित Wnt1 - वंश बेहतर और अवर के रूप में अच्छी तरह से डोपामिनर्जिक वेंट्रल tegmental क्षेत्र और substantia nigra (चित्रा 1D) के सेल आबादी के आसपास के रूप में colliculi (देखें सहित कई midbrain संरचनाओं को जन्म देता है भी 2004 Zervas). इसके विपरीत, E9.5 पर चिह्नित Wnt1 - वंश अवर colliculi के रूप में के रूप में अच्छी तरह से डोपामिनर्जिक सेल आबादी (चित्रा 1F) के आसपास के क्षेत्र में न्यूरॉन्स को जन्म देता है.

चित्रा 1 प्रतिनिधि परिणाम के Wnt1 भाग्य मानचित्रण के लिए.

पूरे माउंट और Wnt1 CreERT में immunocytochemistry परिणाम के उदाहरण, mGFP भ्रूण और वयस्क दिमाग E8.5 (ई.) में मैप (चिह्नित) भाग्यऔर E9.5 (एफई). ए Wnt 1-CreER, E12.5 एक्ज़िबिट midbrain में मुख्य रूप से GFP प्रतिदीप्ति (एमबी), पीछे hindbrain (एचबी) और रीढ़ की हड्डी (सपा) पर mGFP भ्रूण. बी चिह्नित कोशिकाओं कल्पना और immunohistochemistry द्वारा सेलुलर स्तर पर विश्लेषण के रूप में यह 1-सुक्ष्ममापी मोटी ऑप्टिकल अनुभाग (40x उद्देश्य z-श्रृंखला अधिग्रहण) पर दिखाया. परमाणु β-galactosidase एंटीबॉडी (nβ लड़की) (लाल) लेबलिंग और GFP एंटीबॉडी लेबलिंग (हरा) भाग्य प्रतिचित्रित वेंट्रल midbrain में दिखाया कोशिकाओं को इंगित करता है. यहाँ, recombined कोशिकाओं डबल सशर्त mGFP रिपोर्टर की प्रकृति की वजह से सकारात्मक (nβ - लड़की + + / GFP) कर रहे हैं. सी. माउंट - साबुत पुष्पन माइक्रोस्कोपी वयस्क के बेहतर (एससी) colliculi (इनसेट) में बेहोश GFP प्रतिदीप्ति पता चलता है. Wnt1 वयस्क वर्गों पर E8.5 पर कम बढ़ाई साथ चिह्नित वंश का आकलन (5X) माइक्रोस्कोपी से पता चलता है कि Wnt1 वंश (अनुसूचित जाति) के बेहतर और अवर colliculi (आईसी) सहित midbrain संरचनाओं को जन्म देता है है (सी). डी. एक 40x, 1 मिमी ऑप्टिकल nβ - लड़की + कोशिकाओं और एक अमीर + GFP axonal जाल के साथ डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के आसपास के क्षेत्र में ventral midbrain से लिया अनुभाग. ई. E9.5 परिणामों पर पर्याप्त GFP लेबलिंग है कि आसानी से पूरे माउंट प्रतिदीप्ति (इनसेट) द्वारा midbrain के अवर colliculus में मनाया जाता है में चिह्नित. Wnt1 वयस्क वर्गों (β-लड़की + लाल,) पर E9.5 पर चिह्नित वंश अवर colliculus (पृष्ठीय - पीछे midbrain) में केंद्रित है के रूप में कम (5X) बढ़ाई माइक्रोस्कोपी (ई) के साथ देखा है. एफ एक 40x, 1 मिमी ऑप्टिकल nβ - लड़की + कोशिकाओं और एक अमीर + GFP axonal जाल के साथ डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के आसपास के क्षेत्र में ventral midbrain से लिया अनुभाग . Wnt1 व्युत्पन्न E8.5 बनाम E9.5 पर चिह्नित न्यूरॉन्स उत्तरोत्तर पृष्ठीय midbrain में योगदान करने से प्रतिबंधित कर रहे हैं, जबकि Wnt1 वंश वेंट्रल midbrain में योगदान करने में बनी रहती है.

Discussion

GIFM प्रणाली है कि हम दिखा दिया है करने के लिए सेलुलर प्रक्रियाओं की एक किस्म में सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला का जवाब करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, अलग Cre चालकों के साथ इंजीनियर चूहों के लिए किसी भी कोशिका प्रकार, ऊतक या ब्याज की आनुवंशिक वंश लक्ष्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, क्योंकि tamoxifen के किसी भी भ्रूण या प्रसव के बाद समय बिंदु पर प्रशासित किया जा सकता, पुनर्संयोजन किसी भी प्रासंगिक विकास मंच के लिए लक्षित किया जा सकता है. इस प्रणाली के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण जांच कैसे विशेष जीन व्यक्त कोशिकाओं या ब्याज के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विकास के दौरान सेल प्रवास और patterning घटनाओं की संरचना क्षेत्र में योगदान के लिए आदर्श होते हैं.

बस अंकन और visualizing immunohistochemistry (चित्रा 1) द्वारा कोशिकाओं के अलावा, GIFM पद्धति आवेदनों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सशर्त बाहर दस्तक एलील के साथ GIFM संयोजन करके, आनुवंशिक नुकसान के समारोह अस्थायी और spatially प्रासंगिक सेल आबादी, जो एक साथ एक पत्रकार एलील के साथ चिह्नित कर रहे हैं के लिए लक्षित कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, भाग्य मैप किए गए जानवरों से एकत्र ऊतक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी (FACS) के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है शारीरिक रूप से कोशिकाओं को अलग अलग आबादी में रिपोर्टर जीन या विशेष मार्करों व्यक्त. चिह्नित embryogenesis दौरान या वयस्क जानवरों से अलग ऊतकों, सुसंस्कृत हो सकते हैं दवाओं या आनुवंशिक constructs इन विट्रो में परिभाषित प्रजातियों के वितरण की अनुमति .

हमारी प्रयोगशाला GIFM अध्ययन से प्राप्त करने में मदद के लिए जटिल पार्किंसंस रोग, एक प्रकार का पागलपन, आत्मकेंद्रित और tuberous काठिन्य जैसे स्नायविक रोगों, द्वारा उत्पन्न सवालों का जवाब परिणाम का उपयोग करता है. समझ है जो कोशिकाओं की आबादी इन बीमारियों में से प्रत्येक में और कैसे इन आबादियों माउस मॉडल में समय के साथ बदल प्रभावित कर रहे हैं, हम बेहतर समझ विकृति मनाया और यहां तक ​​कि नैदानिक ​​सेटिंग में इलाज के लिए संभव का मतलब मुद्रा की उम्मीद है.