A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark und Track Cells In Vivo Published: December 30, 2009 doi: 10.3791/1687

DOI

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Ashly Brown¹, Stephen Brown², Debra Ellisor², Nellwyn Hagan¹, Elizabeth Normand¹, Mark Zervas²

¹Department of Neuroscience, Division of Biology and Medicine, Brown University, ²Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine, Brown University

Summary

Genetische Inducible Fate Mapping (GIFM) markiert und verfolgt Zellen mit feinen räumlichen und zeitlichen Steuerung

Abstract

Fate Karten sind durch Markierung und Verfolgung von Zellen in vivo zu bestimmen, wie Vorläuferzellen zu bestimmten Strukturen und Zelltypen in Entwicklungsländern beitragen und adulten Gewebe erzeugt. Ein Fortschritt in diesem Konzept ist G enetic ich nducible F aß M apping (GIFM), verbindet die Genexpression, Zell-Schicksal, und Zelle Verhaltensweisen in vivo, um das Schicksal Karten auf genetische Abstammung zu erstellen.

GIFM nutzt X-créer Linien, in denen X ist ein Gen oder eine Gruppe von Gen-regulatorischen Elementen, die räumliche Ausdruck eines veränderten Bakteriophagenprotein, Cre-Rekombinase (Creer ^T) verleiht. Creer ^T enthält eine geänderte e strogen r eceptor Ligandenbindungsdomäne die Creer ^T macht sequestriert im Zytoplasma in Abwesenheit des Medikaments Tamoxifen. Die Bindung von Tamoxifen Releases Creer ^T, die in den Zellkern und vermittelt Rekombination zwischen DNA-Sequenzen von loxP-Stellen flankiert transloziert. In GIFM, Rekombination tritt typischerweise zwischen einem loxP flankiert Stop-Kassette vor einem Reportergen wie GFP.

Mäuse gezüchtet werden, um entweder eine Region-oder Zelltyp-spezifische créer und eine bedingte Reporter Allel enthalten. Unbehandelte Mäuse müssen nicht markiert, da die Stop-Kassette in den Reporter verhindert die weitere Transkription des Reportergens. Wir verwalten Tamoxifen durch orale Gabe zu timed-trächtige Weibchen, die zeitliche Steuerung der Creer ^T Freisetzung und die anschließende Translokation in den Zellkern Entfernen der Stop-Kassette aus dem Reporter bietet. Nach Rekombination ist die Reporter-Allels konstitutiv und heritably ausgedrückt. Die Veranstaltungsreihe markiert Zellen, so dass ihre genetische Geschichte unauslöschlich wird aufgezeichnet. Die rekombiniert Reporter dient somit als High-Fidelity-genetische Abstammung Tracer, der, einmal auf, von der Gen-Expression zunächst zur Creer ^T-Laufwerk entkoppelt ist.

Wir wenden GIFM in der Maus eine normale Entwicklung und ermitteln den Beitrag der genetischen Abstammungslinien zu erwachsenen Zelltypen und Geweben zu untersuchen. Wir verwenden auch GIFM auf Zellen mutierten genetischen Hintergründen folgen, um ein besseres Verständnis komplexer Phänotypen, die hervorstechenden Merkmale des menschlichen genetischen Erkrankungen imitieren.

Dieses Video Artikel führt Forscher durch experimentelle Methoden erfolgreich anzuwenden GIFM. Wir demonstrieren die Methode mit unseren gut charakterisiert Wnt1-créer ^T; mGFP Mäusen durch die Gabe von Tamoxifen bei embryonalen Tag (E) 8,5 über orale Gabe von dissection bei E12.5 und Analyse von Epifluoreszenz Stereomikroskopie gefolgt. Wir zeigen auch, wie die Mikro-sezieren Schicksal abgebildet Domains für Explantation Vorbereitung oder FACS-Analyse und sezieren Erwachsenen Schicksal-mapped Gehirne für ganze Berg Fluoreszenz-Imaging. Gemeinsam ermöglichen diese Verfahren Forscher auf kritische Fragen in der Entwicklungsbiologie und Krankheitsmodelle Adresse.

Protocol

Tamoxifen Vorbereitung und orale Gabe Procedure (E8.5)

• Bereiten Sie eine 20 mg / ml Stammlösung von Tamoxifen durch Auflösen von Tamoxifen in vorgewärmte Maisöl.
• Inkubieren Sie die Lösung bei 37 ° C für 2 Stunden auf einem Kolbenpendel und Wirbel intermittierend.
• Schützen Sie die Tamoxifen Lager vor Licht, Lagerung bei 4 ° C, und die Verwendung von bis zu 1 Monat.
• Für das Schicksal Mapping-Experimente, stellen Sie eine Zucht Paar bestehend aus einem Swiss Webster weiblich (Wildtyp; gekauft Taconic) und ein Männchen, sowohl ein Gen spezifischen Creer ^T-Allel und ein Reporter-Allels. Zu Demonstrationszwecken haben wir mit Wnt1-créer ^T; mGFP Männer (Ellisor 2009).
• Überprüfen Swiss Webster Frauen jeden Morgen für das Auftreten eines Vaginalpfropfes. Bestimmen Sie den Morgen (0900) des Tages ein Vaginalpfropf als 0,5 Tage post-Koitus zu sehen ist und berechnen Sie das Datum der Tamoxifen-Administration auf diesem Ausgangspunkt basiert. (Für dieses Experiment embryonalen Tag 8.5 verwendet wurde).
• Verwenden Sie eine 1 ml Spritze mit einer Tierfütterung Nadel (20G x 1-1/2) zu erarbeiten 200 ul der Tamoxifen-Stammlösung (4 mg Tamoxifen).
• Fest begrenze die Zeit schwanger Swiss Webster Weibchen durch Ergreifen der Nacken und Rücken, den Kopf fixieren und umdrehen, so dass die Bauchseite nach oben zeigt.
• Halten Sie den Schwanz zwischen die Finger frei, um den Körper in einer geraden Linie zu halten.
• Legen Sie die Fütterung Nadel in den Mundwinkel und sanft in die Nadel auf dem Dach des Mundes.
• Drehen Sie die Nadel so, dass es parallel zum Körper ist, während gleichzeitig Kippen der Kopf nach hinten um den Hals gerade zu halten.
• Führen Sie die Nadel durch die Speiseröhre in Richtung Magen. Achten Sie darauf, nicht in die Luftröhre gelangen. Wenn es Widerstand an der Nadel, das Tier Würgereflex eingreift, oder ob die Maus Kämpfe umgehend entfernen Sie die Nadel und versuchen, die Sonde wieder.
• Sobald die Fütterung Nadel in den Bauch, die Verwaltung der Tamoxifen in den Magen und gibt die Frau zu Hause Käfig bis zum Zeitpunkt der Dissektion.

Kraniotomie:

• Intrakardial perfuse der erwachsenen Schicksal abgebildet Maus mit 4% PFA und entfernen Sie den Kopf mit einer Schere durch einen Schnitt durch die Wirbelsäule gerade über die Schultern.
• Run mit einem Skalpell entlang der dorsalen Mittellinie des Kopfes (rostral nach kaudal), um durch die Kopfhaut geschnitten und setzen den Schädel.
• Mit dem Skalpell schaben überschüssiges Gewebe oder Muskel an der Seite und hinteren Teil des Schädels.
• Mit Pinzette, Punktion des Schädels an der Mittellinie nur rostral der Riechkolben und ein kleines Loch in die Spitzen der feinen Schere unterzubringen.
• Legen Sie die feinen Schere in dieses Loch und einen Einschnitt medial nach lateral etwa die Länge der Riechkolben. Dieser Schnitt wird der Schädel an der Kreuzung der nasalen Knochen und Stirnbeins brechen und bieten einen guten Zugang zur Schere.
• Schneiden Sie entlang der Pfeilnaht in den Schädel (dorsalen Mittellinie) Achte darauf, die Schere Tipps vom Gehirn, um eine Beschädigung des darunter liegenden Gewebes Winkel zu halten.
• Fassen Sie den Schädel mit einer Pinzette und abziehen des Knochens entlang der medialen Einschnitt in das Gehirn freizulegen. Der Schädel kann abplatzen in kleine Stücke schneiden oder brechen weg in größere Abschnitte. Fahren Sie mit der Pinzette auf alle frontal, parietal, interparietalen und occipitale zu entfernen.
• Crack the Knochen einschließen des paraflocculi (befindet sich entlang der Seitenkanten des Gehirns auf der Ebene des Kleinhirns) durch Kneifen der sphärischen Knochen auf jeder Seite. Ziehen Sie sich die Knochen.
• Drehen Sie den Kopf auf den Kopf (dorsal Seite nach unten) und die Verwendung der Zange auf die Hirnnerven sever und lassen das Gehirn aus dem Schädel.

Ganze Berge Mikroskopie: erwachsenen Gehirn

• Beurteilen erwachsenen Gehirn für GFP Markierung mit einem fluoreszierenden Binokular.
• Transfer Gehirn eine Petrischale mit PBS und fotografieren mit PictureFrame oder andere geeignete Software.

Ganze Berge Mikroskopie: E12.5 Embryos

• Beurteilen whole mount Embryonen für GFP Markierung mit einem fluoreszierenden Binokular.
• Übertragen Sie diese, dass GFP positive durch whole mount in eine Petrischale mit PBS und fotografieren mit PictureFrame oder andere geeignete Software.
• Verwenden einer Pinzette zu kneifen Sie ein kleines Stück des Schwanzes von jedem Embryo, statt jedes Stück in einem PCR-Röhrchen und Genotyp des Gewebes mit Hilfe der PCR (Ellisor 2009) für beide Allele, um Ergebnisse über ganze Berg Analyse gesehen zu bestätigen.

Micro-Dissektion und Explantation Vorbereitung des ventralen Mittelhirns von E12.5 Embryonen

• Nach Dissektion der uterinen Kette und identification des Schicksals-mapped Embryonen durch ganz-mount Fluoreszenz-Embryonen zu eiskalten sterilen PBS in einer Zellkulturschale.
• Mit einer feinen Schere, entfernen Sie das Kopfteil des Embryos Schneiden quer, kaudal Rhombomer 1.
• Dann entfernen Sie den rostralen Teil des Kopfes mit einem koronalen Schnitt durch das Zwischenhirn. Dies legt ein Rohr-ähnliche Struktur, in der der 4. Ventrikel durch die mesenzephalen Vesikel bilden ein Bindeglied zwischen dorsalen und ventralen Gewebe.
• Schieben Sie die Schere Tipps in den 4. Ventrikel und snip entlang der dorsalen Mittellinie, kaudal rostral, die vollständige Öffnung der Röhre, die Schaffung eines "open-book" Vorbereitung. Die ventralen Mittelhirn wird nun medial ausgesetzt werden, während die beiden dorsalen Hälften des Mittelhirns seitlich befinden wird.
• Entfernen Sie alle verbleibenden nicht-neuronalen Gewebe unterhalb des ventralen Mittelhirns, damit das Gewebe um mehr flach legen. Wenn nötig, machen Kerben in den rostralen und kaudalen Aspekte, so dass die dorsale "Flügel" der Explantation wird flach als auch. Das Explantat sollte nun ein "Schmetterling, in denen die dorsalen Mittelhirn stellt die Flügel, und Rhombomer 1 den Schwanz ähneln.
• Zur weiteren Isolierung des ventralen Mittelhirns für FACS-Analyse oder Zellkultur-Experimenten, entfernen Sie die seitliche (dorsal) des Gewebes.

Repräsentative Ergebnisse:

In diesem GIFM Experiment werden Wnt1-exprimierenden Zellen dauerhaft und heritably während der Embryogenese durch die Gabe von Tamoxifen bei E8.5 zu Wnt1-CreERT markiert; mGFP Embryonen. Anschließend werden diese markierten Zellen visualisiert via ganze Berg Fluoreszenz und Abschnitt Immunhistochemie zu bestimmen, wie Wnt1-abgeleiteten Zellen zu neuralen Strukturen beitragen über die Entwicklung. Whole mount Fluoreszenz beruht auf der Membran gebundene GFP-Komponente des mGFP Reporter und bietet somit zelluläre Informationen sowie eine übergreifende Sicht auf Wnt1-derived neuronalen Projektionen. Zum Beispiel mit Tamoxifen Verwaltung an E8.5, Wnt1-CreERTmGFP Embryonen bei E12.5 zeigen GFP-Fluoreszenz in erster Linie im Mittelhirn, posterior Hinterhirn und Rückenmark (Abbildung 1A). Bei hoher Vergrößerung sind feine neuronalen Projektionen zu sehen innervieren das Mittelhirn, Körper Wand, des Körpers, und kraniofaziale Region. In diesem Entwicklungsstadium ist der Embryo durchsichtig und internen GFP Kennzeichnung ist leicht zu erkennen. Doch wie das Gehirn entwickelt, verschleiert die Dichte von reifem Gewebe GFP-Fluoreszenz aus internen Hirnstrukturen. Deshalb mit Tamoxifen Verwaltung an E8.5, ist nur geringe GFP-Markierungen in der überlegenen colliculi der Erwachsenen durch whole mount-Fluoreszenz (Abbildung 1C, Einschub) beobachtet. Darüber hinaus sind einige axonale Projektionen zu sehen Coursing entlang der ventralen Oberfläche des Rautenhirn (nicht dargestellt). Im Gegensatz dazu, wenn Tamoxifen bei E9.5 verabreicht wird, tritt erhebliche GFP-Markierungen in der gesamten unteren Vierhügel (Abb. 1B, Einschub). Dieser Anstieg der ganze Berg Fluoreszenz kann darauf hindeuten, dass Wnt1-exprimierenden Zellen an E9.5 mehr wesentlich zur oberflächlichen Regionen der dorsalen Mittelhirn oder zu erweitern mehr Prozesse in dieser Region als Wnt1 exprimierenden Zellen aus E8.5. Egal, spiegelt dieser Unterschied in whole mount Fluoreszenz der dynamischen Natur der Wnt1 Expression während der Entwicklung und zeigt, wie GIFM verwendet werden, um unterschiedliche Zellpopulationen aus dem Embryo folgen in den reifen Erwachsenen werden.

Mit Immunhistochemie, Schicksal abgebildet Gewebeschnitte von Wnt1-CreERT; mGFP Tiere sind auf zellulärer Ebene analysiert. Antikörper gegen GFP und β-Galactosidase (β-gal) in Verbindung mit einer Vielzahl von Gewebe spezifische Biomarker verwendet werden, um die feinen Skala zellulären Beitrag der Wnt1 Linie auf neuronale Strukturen und Zelltypen zu bestimmen. Mit Tamoxifen Verwaltung an E8.5 und Gewebe-Analyse bei E12.5-, Doppel-positive Zellen (GFP + und β-gal +) sind über das Mittelhirn und Hinterhirn mit Projektionen Coursing durch die ventrale Mittelhirn (Abbildung 1B) beobachtet. Im erwachsenen Gehirn, gibt der Wnt1-Linie bei E8.5 deutlichen Anstieg zu vielen Mittelhirn Strukturen einschließlich der oberen und unteren Colliculi sowie in der Nähe von dopaminergen Zellpopulationen des ventralen Tegmentum und der Substantia nigra (1D) (siehe Auch Zervas 2004). Im Gegensatz dazu gibt die Wnt1-Linie bei E9.5 deutlichen Anstieg um minderwertige colliculi sowie Neuronen in der Nähe von dopaminergen Zellpopulationen (Abb. 1F).

Abbildung 1 repräsentative Ergebnisse für Wnt1-Schicksal-Mapping.:

Beispiele für Ganzkörper-Halterung und Immunzytochemie Ergebnisse in Wnt1-CreERT; mGFP Embryonen und erwachsenen Gehirn Schicksal abgebildet (markiert) an E8.5 (AD)und E9.5 (EF). A. Wnt 1-Creer; mGFP Embryonen bei E12.5 zeigen GFP-Fluoreszenz in erster Linie im Mittelhirn (Mb), posterior Hinterhirn (Hb) und des Rückenmarks (Sp). B. Markierte Zellen visualisiert und analysiert werden auf zellulärer Ebene durch Immunhistochemie wie auf dieser 1-mu m dicken optischen Schnitt (40fach Objektiv, z-series-Akquisition) gezeigt. Nuclear β-Galactosidase (nβ-gal) Antikörpermarkierung (rot) und GFP Antikörpermarkierung (grün) zeigt das Schicksal-mapped Zellen im ventralen Mittelhirn gezeigt. Hier werden rekombinierten Zellen doppelt positiven (nβ-gal + / GFP +) wegen der Art der bedingten mGFP Reporter. C. Whole-mount florescence Mikroskopie zeigt schwache GFP-Fluoreszenz in den Superior Colliculus (SC) der erwachsenen (kleines Bild). Die Beurteilung der Wnt1 Linie an E8.5 an adulten gekennzeichneten Felder mit geringer Vergrößerung (5x)-Mikroskopie zeigt, dass die Wnt1 Linie Anlass zu Mittelhirn Strukturen einschließlich der superior (SC) und inferior (IC) Colliculi (C). D. A 40x, 1 mm optischer Schnitt aus dem ventralen Mittelhirn in der Nähe von dopaminergen Neuronen mit nβ-gal +-Zellen und eine reiche GFP + axonalen Plexus entnommen. E. Markierung an E9.5 Ergebnisse in wesentlichen GFP-Markierungen, die leicht in den Colliculus inferior des Mittelhirns durch whole mount Fluoreszenz (kleines Bild) zu beobachten ist. Die Wnt1 Linie an E9.5 an adulten Abschnitte (β-gal +, rot) markiert ist im Colliculus inferior (dorsal-posterior Mittelhirn) konzentriert wie bei geringer Vergrößerung (5x)-Mikroskopie (E) zu sehen. F. A 40x, 1 mm optischer Schnitt aus dem ventralen Mittelhirn in der Nähe von dopaminergen Neuronen mit nβ-gal +-Zellen und eine reiche GFP + axonalen Plexus entnommen. Wnt1-derived Neuronen an E8.5 E9.5 Vergleich gekennzeichnet sind, schrittweise von ihrem Beitrag zur dorsalen Mittelhirn beschränkt, während die Wnt1 Linie weiterhin einen Beitrag zur ventralen Mittelhirn.

Discussion

Die GIFM System, das wir haben gezeigt, kann ein breites Spektrum von Fragen in einer Vielzahl von zellulären Prozessen zu beantworten. Zum Beispiel können Mäuse mit unterschiedlichen Cre-Treiber entwickelt, verwendet werden, um jeden Zelltyp, Gewebe-oder genetische Linie des Interesses Ziel sein. Darüber hinaus, weil Tamoxifen jederzeit embryonalen oder postnatale Zeitpunkt verabreicht werden kann, kann Rekombination, alle relevanten Entwicklungsstadium ausgerichtet sein. Die räumliche und zeitliche Steuerung dieses Systems sind ideal für die Untersuchung, wie Zellen, die bestimmte Gene auf eine Struktur oder eine Region von Interesse sind, sowie die Zellwanderung und Strukturierung Ereignisse während der Entwicklung beitragen.

Neben dem einfachen Kennzeichnung und Visualisierung von Zellen durch Immunhistochemie (Abbildung 1), kann GIFM Methodik für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden. Durch die Kombination GIFM mit einem konditionalen Knock-out-Allels kann genetische loss-of-function zeitlich und räumlich relevanten Zellpopulationen, die gleichzeitig mit einem Reporter-Allels sind markiert ausgerichtet. Alternativ kann Gewebe vom Schicksal abgebildet Tieren gesammelt in Kombination mit Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) verwendet werden, um physisch zu isolieren Zellen, die Reporter-Gene oder bestimmte Marker in verschiedenen Populationen. Markierte Gewebe während der Embryogenese oder bei erwachsenen Tieren isoliert werden kultiviert werden, so dass die Abgabe von Medikamenten oder genetische Konstrukte definiert Linien in vitro.

Unser Labor verwendet die Ergebnisse von Studien GIFM erhalten zur Beantwortung komplexer Fragen, die von neurologischen Erkrankungen, wie Parkinson-Krankheit, Schizophrenie, Autismus und Tuberöse Sklerose gestellt. Durch das Verständnis, welche Populationen von Zellen in jeder dieser Krankheiten und wie diese Populationen im Laufe der Zeit in Mausmodellen Änderung betroffen sind, hoffen wir, zum besseren Verständnis der Pathologie beobachtet und selbst darstellen kann mittels Behandlung in klinischen Umgebungen.