Summary
Генетические индуцибельной Судьба картирования (GIFM) знаки и треков клеток с тонкой пространственной и временной контроль
Protocol
Тамоксифен Подготовка и устные зонд процедуры (E8.5)
- Подготовка 20 мг / мл исходного раствора тамоксифен, растворяя тамоксифен в подогретого кукурузное масло.
- Инкубируйте раствор при 37 ° С в течение 2 часов на nutator и вихревые периодически.
- Защита тамоксифен фондовом от света месте, хранить при 4 ° С, и использовать на срок до одного месяца.
- Для экспериментов судьба отображение, создание племенных пар, состоящих из швейцарских Вебстер женщины (дикого типа, приобретенных у Taconic) и мужчин и проведение конкретных генов Крир аллеля Т и репортер аллеля. Для демонстрационных целей, мы используем Wnt1-Крир Т; mGFP мужчин (Ellisor 2009).
- Проверьте швейцарские женщины Вебстер каждое утро в течение появление вагинальной пробки. Назначить утро (0900) в день вагинальных плагин считается 0,5 дней после полового акта и вычислить дату администрации тамоксифена на основе этой отправной точки. (Для этого эксперимента, эмбриональные день было использовано 8,5).
- Используйте 1 мл шприц с иглой для кормления животных (20G х 1-1/2) составить 200 мкл раствора тамоксифен акции (4 мг тамоксифена).
- Твердо сдерживать времени беременных женщин швейцарских Вебстер, держа задней части шеи и спины, чтобы обездвижить голову и перевернуть так брюшную сторону вверх.
- Держите хвост между свободными пальцы, чтобы держать тело в прямую линию.
- Место кормления иглу в углу рта и нежно руководство иглы по небу.
- Вращайте иглу так, чтобы она параллельно телу, одновременно наклоняя голову назад, чтобы держать шею прямо.
- Руководство иглу вниз по пищеводу, в сторону желудка. Будьте осторожны, чтобы не ввести в трахею. Если есть сопротивление на иглу, кляп животного занимается рефлекс, или, если мышь борьбы, немедленно удалить иглу и попробуйте зонд снова.
- После кормления игла находится в желудке, администрирования тамоксифен в желудок и возвращения женщины к ее дому клетке до даты вскрытия.
Краниотомия:
- Intracardially заливать взрослых судьба отображается мышь с 4% PFA и удалить голову с ножницами, сокращая через позвоночник чуть выше плеч.
- Выполнить скальпелем вдоль спинной средней линии головы (ростральной к хвосту), чтобы прорваться через кожу головы и подвергать черепа.
- Использование скальпеля, соскрести лишнюю ткань или мышцы вдоль боковой и задней черепной коробки.
- С щипцы, прокол черепа в средней линии просто ростральнее обонятельных луковиц и создать небольшое отверстие для размещения кончиками тонких ножниц.
- Вставьте тонкий ножницы в это отверстие и сделать разрез медиальнее боковые приблизительно на длину обонятельных луковиц. Этот отрезок сломается черепа на пересечении носовой кости и лобной кости и обеспечивают хороший доступ для ножницами.
- Разрезать вдоль сагиттального швов в черепе (спинной средней линии) и обязательно держать ножницы советы угловые от мозга во избежание повреждения основной ткани.
- Аккуратно понять черепа пинцетом и удаляйте кости вдоль медиальной разрез подвергать мозга. Череп может чип с небольшими кусочками или оторваться в больших разделах. Продолжайте использовать пинцет, чтобы удалить все лобной, теменной, межтеменной, и затылочной костей.
- Трещина кости упаковывая paraflocculi (расположенного вдоль боковых краев мозга на уровне мозжечка), зажимая сферической кости с каждой стороны. Осторожно потяните от костей.
- Включите голову вверх дном (спинной стороной вниз) и использовать щипцы разорвать черепных нервов и освободить мозг от черепа.
Всего микроскопии горе: Взрослый мозг
- Оценка взрослого мозга для GFP маркировки использованием флуоресцентных рассекает области.
- Передача мозга чашке Петри содержащие PBS и сфотографировать использованием PictureFrame или другого соответствующего программного обеспечения.
Всего микроскопии горе: E12.5 Эмбрионы
- Оценка целых зародышей крепление для GFP маркировки использованием флуоресцентных рассекает области.
- Передача те, которые являются положительными GFP целыми крепления к чашке Петри содержащие PBS и сфотографировать использованием PictureFrame или другого соответствующего программного обеспечения.
- Используйте пинцет, чтобы отщипывать кусочек хвоста от каждого эмбриона, поместить каждую часть в ПЦР-пробирку и генотип ткани с помощью ПЦР (Ellisor 2009) для обоих аллелей, чтобы подтвердить результаты, полученные через весь анализ монтирования.
Микро-вскрытие и подготовка эксплантатов брюшной средний мозг от E12.5 эмбрионов
- После вскрытия из матки цепи и идентификаторentification судьбы отображаемой эмбрионов целыми монтажа флуоресценции, трансфер эмбрионов ледяной стерильной PBS в блюдо культуре клеток.
- Использование тонких ножниц, удалить голову части эмбриона резка в поперечном направлении, каудально rhombomere 1.
- Затем удалите ростральной части головы короны прорезать промежуточного мозга. Это выставит ламповую структуру, в которой 4-го желудочка через мезенцефальных форму пузырька связующим звеном между спинной и брюшной ткани.
- Осторожно вставьте ножницеобразный наконечниками в 4-й желудочек, и надрез вдоль спинной средней линии, каудально ростральной, полностью открыть трубу, создание "открытой книги" подготовки. Вентрального среднего мозга теперь она подвергнется медиально, а два спинных половин мозга будет находиться сбоку.
- Удалите все оставшиеся без нервной ткани под вентрального среднего мозга для того, чтобы ткань лежала более решительно. В случае необходимости, сделать вырезы в ростральной и хвостовой аспекты, такие, что спинной «крыльях» эксплантов будет лежать, а также. Эксплантов должна выглядеть "бабочка, в котором спинной мозга представляет крылья, и rhombomere один хвост.
- Для еще большей изоляции вентрального среднего мозга для анализа FACS или экспериментов культуре клеток, удалите боковые (спинной стороны) ткани.
Представитель Результаты:
В этом GIFM эксперимент, Wnt1-экспрессирующие клетки постоянно и heritably отмеченные во время эмбриогенеза путем введения тамоксифена на E8.5 к Wnt1-CreERT; mGFP эмбрионов. Впоследствии эти клетки помечены визуализируются с помощью целого флуоресценции смонтировать и раздел иммуногистохимии чтобы определить, как Wnt1 клеток, полученных способствовать нервных структур по развитию. Всего горе флуоресценции зависит от мембраносвязанных GFP компонент репортер mGFP и, следовательно, обеспечивает сотовой информации, а также всеобъемлющие зрения Wnt1 полученных нейронных проекций. Например, с тамоксифеном управления на E8.5, Wnt1-CreERTmGFP эмбрионов на E12.5 выставку GFP флуоресценции в основном в средний мозг, задний задний мозг и спинной мозг (рис. 1А). При большом увеличении, тонкой нейронов прогнозы видел иннервирующих мозга, стенки тела, конечностей, а также черепно-лицевой области. На этой стадии развития эмбрион является прозрачным и внутренней маркировки GFP легко различить. Однако, как мозг развивается, плотность зрелые ткани скрывает GFP флуоресценции, исходящие из внутренних структур мозга. Таким образом, с тамоксифеном управления на E8.5, лишь незначительные маркировки GFP наблюдается в превосходной холмов среди взрослого целыми горе флуоресценции (рис. 1С, вставка). Кроме того, некоторые аксонального прогнозы видел бегущую вдоль брюшной поверхности заднего мозга (не показаны). Напротив, когда тамоксифен назначали в E9.5 значительные маркировки GFP происходит во всем уступает холмов (рис. 1В, вставка). Это увеличение в целом флуоресценции крепление может означать, что Wnt1-клеток, экспрессирующих на E9.5 способствовать более существенный вклад поверхностных областях спинного мозга или расширить несколько процессов в этом регионе, чем Wnt1 клеток, экспрессирующих от E8.5. В любом случае, эта разница в целом горе флуоресценции отражает динамическую природу Wnt1 выражения во время разработки и демонстрирует, как GIFM могут быть использованы следовать разные популяции клеток из эмбриона в зрелые взрослые.
С иммуногистохимии, судьба отображаются разделы ткани Wnt1-CreERT; mGFP животных анализируются на клеточном уровне. Антитела против GFP и β-галактозидазы (β-Gal) используются в сочетании с разнообразием тканей специфических биомаркеров для определения мелкого масштаба сотовой вклад Wnt1 происхождение от нервных структур и клеточных типов. С тамоксифена управления на E8.5 и тканей анализа на E12.5 дважды положительных клеток (GFP + и β-гал +) наблюдаются по всему среднего и заднего мозга с проекциями пробегает по вентрального среднего мозга (рис. 1В). Во взрослом мозге, Wnt1-линии отмечены на E8.5 порождает многие структуры мозга, включая высших и низших холмов, а также в непосредственной близости от дофаминергических клеточных популяций вентральной области покрышки и черной субстанции (рис. 1D) (см. Также Зервас 2004). В противоположность этому, Wnt1-линии отмечены на E9.5 порождает уступает холмов, а также нейроны в непосредственной близости от дофаминергических клеточных популяций (рис. 1F).
Рисунок 1 представитель Результаты Wnt1-рок отображения.:
Примеры целом монтажа и иммуноцитохимии приводит Wnt1-CreERT; mGFP эмбрионов и взрослых судьба мозги отображается (помечены) в E8.5 (AD)и E9.5 (EF). А. Wnt 1-Крир; mGFP эмбрионов на E12.5 выставку GFP флуоресценции в первую очередь в среднем мозге (Мб), задний задний мозг (Hb) и спинного мозга (Sp). Б. Помечено в клетках визуализироваться и анализироваться на клеточном уровне, иммуногистохимии, как показано на этом 1-мкм оптической части (40x цели, г-серии приобретения). Ядерный β-галактозидазы (nβ-гал) антител маркировку (красный) и GFP антител маркировки (зеленый) показывает судьба отображаемой клетки показано на вентральной мозга. Здесь рекомбинированное клетки двойной положительный (nβ-гал + / GFP +) из-за характера условного репортер mGFP. C. Всего монтажа расцвета микроскопия выявляет слабые флуоресценции GFP в превосходной холмов (SC) для взрослых (вставка). Оценка Wnt1 линии отмечены на E8.5 на взрослых участки с низким увеличением (5X) микроскопия показывает, что Wnt1 линии порождает мозга структур, включая улучшенный (SC) и нижней (IC) холмов (С). Д. 40x, 1 мм оптической части взяты из вентрального среднего мозга в непосредственной близости от дофаминергических нейронов с nβ-гал + клеток и богатой GFP + аксонального сплетения. Е. Маркировка на результаты E9.5 к существенному маркировки GFP, который легко наблюдается в нижних бугорок среднего мозга целыми горе флуоресценции (вставка). Wnt1 линии отмечены на E9.5 на взрослых секций (β-гал +, красный) сосредоточена в нижних бугорок (спинно-заднем среднего мозга), как видно с низким увеличением (5X) микроскопии (Е). Ф. 40x, 1 мм оптической части взяты из вентрального среднего мозга в непосредственной близости от дофаминергических нейронов с nβ-гал + клеток и богатой GFP + аксонального сплетения. Wnt1 полученных нейронов отмечается при сравнении E8.5 E9.5 постепенно запрещено способствует спинного мозга, в то время Wnt1 линии сохраняется в содействии вентрального среднего мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GIFM система, которую мы продемонстрировали, могут быть использованы для ответа широкий круг вопросов в различных клеточных процессов. Например, мыши разработана с различными драйверами Cre может быть использована для целевых любого типа клеток, тканей или генетической линии интересов. Кроме того, поскольку тамоксифен могут быть введены в любой эмбриональный или послеродового момент времени, рекомбинации могут быть направлены на любой соответствующей стадии развития. Пространственным и временным контролем этой системы идеально подходят для исследования клеток, экспрессирующих как конкретные гены способствуют структуры или область интереса, а также миграции клеток и структурирование событий в процессе разработки.
Помимо того, что маркировка и визуализации клеток иммуногистохимии (рис. 1), GIFM методология может быть использована для различных приложений. Объединив GIFM с условным нокаут аллель, генетические потерей функции может быть во времени и пространстве, ориентированные на соответствующие клеточные популяции, которые являются одновременно отмечены репортер аллеля. Кроме того, ткань собранные от судьбы отображается животные могут быть использованы в сочетании с флуоресцентной-активированный сортировки клеток (FACS), чтобы физически изолировать клеток, экспрессирующих гены репортера или отдельных маркеров в различных популяциях. Помечено в тканях изолированы во время эмбриогенеза или из взрослых животных может быть культурным, позволяя доставки лекарств или генетические конструкции для линий определены в лабораторных условиях.
Наша лаборатория использует результаты, полученные из GIFM исследования, чтобы помочь ответить на сложные вопросы, связанные с неврологическими заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона, шизофрения, аутизм и клубневые склероз. Понимая, какие группы населения клеток пострадавших в каждом из этих заболеваний, и как эти группы населения меняться с течением времени на мышах, мы надеемся, чтобы лучше понять патологии наблюдается и даже привести к возможным средством лечения в клинических условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы способствовали в равной степени к этой работе и перечислены в алфавитном порядке. Вклад каждого отдельного очевидно, его или ее участие в видео-статьи.
Acknowledgments
Мы благодарны С. Арбер для mGFP мышей и членам лаборатории Зервас, кто критически прочитать документ и оказала техническую помощь. А. Браун был поддержан наук о мозге Каплан летних исследований Высшей премии. Е. Normand была поддержана Программой наук о мозге премии исследований Высшей. Это исследование было также финансируются запуске научно-исследовательские фонды (МЗ).
References
- Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system. Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
