Summary
Genéticos inducible destino de asignación (GIFM) las marcas y las células de las pistas con un control preciso espacial y temporal
Abstract
Los mapas son generados por el destino marcado y seguimiento de las células in vivo para determinar cómo los progenitores contribuyen a estructuras específicas y los tipos de células en el desarrollo y los tejidos adultos. Un avance en este concepto es que G enetic nducible F comió M apping (GIFM), que une la expresión génica, el destino celular, y el comportamiento de células in vivo, para crear mapas de destino basada en el linaje genético.
GIFM explota X-Creer líneas donde X es un gen o un conjunto de elementos reguladores de genes que confieren expresión espacial de una proteína bacteriófagos modificados, la recombinasa Cre (Creer T). Creer T contiene una modificación e estrogénico r dominio ligando eceptor vinculante que hace Creer T secuestrado en el citoplasma en ausencia de la droga tamoxifeno. La unión de tamoxifeno versiones Creer T, que se transloca al núcleo y la recombinación media entre las secuencias de ADN flanqueado por sitios loxP. En GIFM, la recombinación se produce normalmente entre un casete loxP flanqueado parada antes de un gen reportero, como las buenas prácticas agrarias.
Los ratones son criados para contener una región o tipo de células específicas Creer y un alelo reportero condicional. Los ratones no tratados no se han marcado por la cinta parada en el Boletín previene la transcripción más del gen reportero. Nosotros administramos el tamoxifeno por sonda oral a tiempo, las mujeres embarazadas, que proporciona un control temporal de la liberación Creer T y posterior translocación al núcleo de quitar el cassette parada de la periodista. Después de la recombinación, el alelo periodista es constitutivamente y expresó heritably. Esta serie de eventos marca las células de tal manera que su historia genética está indeleblemente grabada. El periodista recombinados por lo tanto sirve como un marcador de linaje genético de alta fidelidad que, una vez encendido, es desacoplada de la expresión de los genes utilizados inicialmente para conducir T CREER.
Aplicamos GIFM en ratón para estudiar el desarrollo normal y la contribución de determinar el linaje genético de los tipos de células y tejidos adultos. También utilizamos GIFM para seguir las células mutantes en las bases genéticas para comprender mejor los fenotipos complejos que imitan características principales de trastornos genéticos humanos.
En este artículo de vídeo guías investigadores a través de métodos experimentales para aplicar con éxito GIFM. Demostramos el método que utiliza nuestro bien caracterizados Wnt1-Creer T, los ratones mediante la administración de tamoxifeno mGFP en el día embrionario (E) 8.5 a través de una sonda nasogástrica seguida de disección en E12.5 y análisis por microscopía estereoscópica epifluorescencia. También se muestra cómo micro-disección de dominios destino asignado para la preparación del explante o análisis FACS y diseccionar adultos mapeado destino, los cerebros de toda imagen de montaje fluorescente. En conjunto, estos procedimientos permiten a los investigadores a abordar las cuestiones críticas en la biología del desarrollo y modelos de enfermedades.
Protocol
El tamoxifeno Preparación y Procedimiento sonda nasogástrica (E8.5)
- Preparar a 20 mg / ml de solución stock de tamoxifeno por disolución de tamoxifeno en el aceite de maíz pre-calentado.
- Incubar la solución a 37 ° C durante 2 horas en un nutator y agitar de forma intermitente.
- Proteger a la población de la luz con tamoxifeno, se almacenan a 4 ° C, y el uso de hasta un mes.
- Para los experimentos de mapeo de destino, establecer un par de crianza que consiste en una hembra Swiss Webster (de tipo salvaje, compró de Taconic) y un macho lleva a la vez un gen específico CREER alelo T y un alelo reportero. Para fines de demostración, estamos usando Wnt1-Creer T; hombres mGFP (Ellisor 2009).
- Compruebe suizo hembras Webster cada mañana por la aparición de un tapón vaginal. Designar a la mañana (0900) del día se ve un tapón vaginal como 0,5 días post-coito y calcular la fecha de administración de tamoxifeno sobre la base de este punto de partida. (Para este experimento, el día embrionario 8.5 se utilizó).
- Use una jeringa de 1 ml con una aguja de alimentación de los animales (20 G x 1-1/2) para elaborar 200 l de la solución madre de tamoxifeno (4 mg tamoxifeno).
- Firmemente limitar el tiempo del embarazo suizos Webster mujer agarrando la nuca del cuello y la espalda para inmovilizar la cabeza y vuelta para el lado ventral hacia arriba.
- Mantenga la cola entre los dedos libres para mantener el cuerpo en una línea recta.
- Coloque la aguja de alimentación en la esquina de la boca y guiar la aguja a lo largo del techo de la boca.
- Gire la aguja de modo que quede paralela al cuerpo, al mismo tiempo que se inclina la cabeza hacia atrás para mantener el cuello recto.
- Guiar la aguja a través del esófago hacia el estómago. Tenga cuidado de no entrar en la tráquea. Si hay resistencia a la aguja, se dedica al animal reflejo nauseoso, o si el ratón luchas, retire inmediatamente la aguja y tratar la sonda de nuevo.
- Una vez que la aguja de alimentación está en el estómago, administrar el tamoxifeno en el estómago y el retorno a la hembra a su jaula hasta la fecha de la disección.
Craneotomía:
- Intracardial perfundir el destino asignado para adultos ratón con 4% PFA y quitar de la cabeza con unas tijeras cortando a través de la columna vertebral justo por encima de los hombros.
- Ejecutar un bisturí a lo largo de la línea media dorsal de la cabeza (rostral a caudal) para cortar el cuero cabelludo y exponer el cráneo.
- Utilizando el bisturí, raspar el exceso de tejido o músculo de largo del lado y posterior del cráneo.
- Con unas pinzas, perforar el cráneo en la línea media, justo rostral al bulbo olfativo y crear un pequeño agujero para dar cabida a la punta de unas tijeras finas.
- Introduzca las tijeras finas en este agujero y hacer una incisión medial a lateral aproximadamente de la longitud de los bulbos olfatorios. Este corte se rompió el cráneo en la intersección de los huesos de la nariz y el hueso frontal y proporcionar un buen acceso a las tijeras.
- Corte a lo largo de la sutura sagital en el cráneo (dorsal línea media), asegurándose de mantener la puntas de las tijeras en ángulo lejos del cerebro para evitar dañar el tejido subyacente.
- Pellizque suavemente la cabeza con unas pinzas y retire el hueso largo de la incisión medial para exponer el cerebro. El cráneo puede saltar en pedazos pequeños o separarse en secciones más grandes. Seguir utilizando las pinzas para quitar todos los huesos frontal, parietal, interparietal y occipital.
- Romper los huesos que encierra la paraflocculi (que se encuentra a lo largo de los bordes laterales del cerebro a nivel del cerebelo) apretando los huesos esféricas a cada lado. Tire suavemente lejos los huesos.
- Gire la cabeza hacia abajo (lado dorsal hacia abajo) y el uso de las pinzas para cortar los nervios craneales y la liberación del cerebro en el cráneo.
Microscopía todo el monte: cerebrales en adultos
- Evaluar el cerebro adulto de la GFP se utiliza un microscopio marca fluorescente de disección.
- Transferencia de cerebros a un plato de Petri con PBS y la fotografía usando PictureFrame o el software apropiado.
Microscopía todo el monte: E12.5 embriones
- Evaluar embriones todo el montaje de las buenas prácticas agrarias marca se utiliza una sonda fluorescente de disección.
- Transferencia de las buenas prácticas agrarias que son positivos por el montaje de todo a un plato de Petri con PBS y la fotografía usando PictureFrame o el software apropiado.
- El uso de fórceps para desprender una pequeña porción de la cola de cada embrión, colocar cada pieza en un tubo de PCR y el genotipo de los tejidos mediante PCR (Ellisor 2009) para los dos alelos para confirmar los resultados observados a través del análisis conjunto de montaje.
Micro-disección y preparación de los explantes de mesencéfalo ventral de E12.5 embriones
- Después de la disección de la cadena del útero y la identificaciónentification de asignar el destino de embriones por todo el montaje de fluorescencia, los embriones de transferencia de helado de PBS estéril en una placa de cultivo celular.
- Usando tijeras finas, eliminar la parte de la cabeza del embrión de corte transversal, caudal de rhombomere 1.
- A continuación, retire la porción rostral de la cabeza con un corte coronal a través del diencéfalo. Esto expondrá una estructura similar a un tubo en el que el ventrículo cuarto a través de la forma de la vesícula mesencefálica un conducto entre los tejidos dorsal y ventral.
- Con cuidado, inserte la punta de tijera en el ventrículo cuarto, y cortar a lo largo de la línea media dorsal, caudal a rostral, la apertura total del tubo, la creación de un "libro abierto" de preparación. El mesencéfalo ventral ahora estarán expuestos medial, mientras que las dos mitades dorsal del mesencéfalo se encuentran lateralmente.
- Eliminar cualquier resto de tejido neural no por debajo del mesencéfalo ventral para que el tejido a poner más rotundamente. Si es necesario, hacer muescas en los aspectos rostral y caudal de tal manera que el dorsal "alas" del explante se tumbó también. El explante de ahora debe ser similar a una mariposa ", en la que el mesencéfalo dorsal representa las alas, y un rhombomere la cola.
- A fin de aislar el mesencéfalo ventral para el análisis de FACS o experimentos de cultivo celular, quitar el lateral (cara dorsal) del tejido.
Los resultados representativos:
En este experimento GIFM, Wnt1 células que expresan de forma permanente y durante la embriogénesis heritably marcados por la administración de tamoxifeno a E8.5 a Wnt1-CreERT; embriones mGFP. Posteriormente, estas células marcadas se visualizan a través de toda la fluorescencia de montaje e inmunohistoquímica sección para determinar cómo Wnt1 células derivadas de contribuir al desarrollo a través de las estructuras nerviosas. Toda la fluorescencia de montaje se basa en el componente de la membrana GFP obligado de la periodista mGFP y por lo tanto proporciona información celular, así como una visión general de Wnt1 derivados de las proyecciones neuronales. Por ejemplo, con la administración de tamoxifeno a E8.5, Wnt1-CreERTmGFP embriones en E12.5 fluorescencia de GFP muestran principalmente en el mesencéfalo, rombencéfalo posterior y la médula espinal (Figura 1). A mayor aumento, bien proyecciones neuronales se ven que inervan el cerebro medio, la pared del cuerpo, las extremidades y la región craneofacial. En esta etapa de desarrollo, el embrión es translúcido y etiquetado de las buenas prácticas agrarias interna es fácil de discernir. Sin embargo, como el cerebro se desarrolla, la densidad de los tejidos maduros oscurece fluorescencia de GFP que emanan de las estructuras cerebrales internas. Por lo tanto, con la administración de tamoxifeno a E8.5, sólo las buenas prácticas agrarias de etiquetado menor se observa en el colículo superior de los adultos por toda la fluorescencia de montaje (Figura 1C, recuadro). Además, algunas proyecciones axonales se ven circulando por la superficie ventral del cerebro posterior (no mostrado). En contraste, cuando se administra tamoxifeno en E9.5, etiquetado GFP sustancial se produce en todo el colículo todo inferior (fig. 1B, recuadro). Este aumento en toda la fluorescencia de montaje puede indicar que Wnt1 células que expresan en E9.5 contribuir más significativamente a las regiones superficiales del cerebro medio dorsal o ampliar más los procesos dentro de esta región que Wnt1 células que expresan de E8.5. De todos modos, esta diferencia en el conjunto de fluorescencia montaje refleja la naturaleza dinámica de Wnt1 expresión durante el desarrollo y demuestra cómo GIFM se puede utilizar para seguir las distintas poblaciones de células del embrión en el adulto maduro.
Con técnicas de inmunohistoquímica, las secciones de tejido destino asignado a partir de Wnt1-CreERT; animales mGFP se analizan a nivel celular. Los anticuerpos contra la GFP y β-galactosidasa (β-gal) se utilizan en combinación con una variedad de biomarcadores específicos de tejido para determinar la contribución a escala fina celular del linaje Wnt1 a las estructuras neuronales y tipos de células. Con la administración de tamoxifeno a E8.5 y análisis de tejidos a E12.5, doble células positivas (GFP + y β-gal +) se observan en todo el cerebro medio y cerebro posterior con las proyecciones de correr por el cerebro medio ventral (fig. 1B). En el cerebro adulto, el Wnt1 linaje marcado en E8.5 da lugar a estructuras del cerebro medio incluyendo muchos los tubérculos cuadrigéminos superiores e inferiores, así como en las cercanías de las poblaciones de células dopaminérgicas del área tegmental ventral y la sustancia negra (Figura 1 D) (véase También Zervas 2004). En contraste, el linaje Wnt1 marcado en E9.5 da lugar a colículo inferior, así como a las neuronas en las cercanías de las poblaciones de células dopaminérgicas (Figura 1 F).
Figura 1 Los resultados representativos para el mapeo de Wnt1-destino.:
Ejemplos de todo el montaje y los resultados de inmunocitoquímica en Wnt1-CreERT; embriones mGFP y el destino de los cerebros adultos mapa (marcado) a E8.5 (AD)y E9.5 (EF). A. Wnt 1-Creer; mGFP embriones en E12.5 fluorescencia de GFP muestran principalmente en el cerebro medio (Mb), parte posterior del cerebro posterior (Hb) y la médula espinal (Sp). Las células B. Marcado visualizar y analizar a nivel celular mediante técnicas de inmunohistoquímica, como se muestra en este 1-m de espesor óptico de la sección (objetivo de 40x, la serie Z de adquisición). Nuclear β-galactosidasa (nβ-gal) el etiquetado de anticuerpos (rojo) y el etiquetado de anticuerpos GFP (verde) indica que asigna el destino de las células se muestra en el cerebro medio ventral. Aquí, las células recombinadas son doble positivo (nβ-gal + / GFP +) debido a la naturaleza de la periodista mGFP condicional. C. Todo el montaje de microscopía de fluorescencia revela tenue fluorescencia de GFP en el colículo superior, (SC) de los adultos (recuadro). Evaluar el linaje Wnt1 marcado en E8.5 en las secciones para adultos con bajo aumento (5 veces) microscopía revela que el linaje Wnt1 da lugar a estructuras del cerebro medio como el superior (SC) e inferior (IC) colículo (C). D. A 40x, 1 mm óptica sección tomada desde el cerebro medio ventral en la vecindad de las neuronas dopaminérgicas con células gal nβ-GFP + y un rico plexo axonal +. E. Marcado de los resultados E9.5 en el etiquetado de las buenas prácticas agrarias importante que se observa fácilmente en el colículo inferior del cerebro medio por toda la fluorescencia de montaje (recuadro). El linaje Wnt1 marcado en E9.5 en las secciones para adultos (β-gal +, rojo) se concentra en el colículo inferior (dorsal-posterior del cerebro medio) como se ve con bajo aumento (5 veces) microscopía (E). F. A 40x, 1 mm de sección óptica tomada del cerebro medio ventral en la vecindad de las neuronas dopaminérgicas con células gal nβ-GFP + y un rico plexo axonal +. Wnt1 neuronas derivadas de marcado en E8.5 E9.5 frente se restrinja progresivamente de contribuir al cerebro medio dorsal, mientras que el linaje Wnt1 persiste en la contribución a cerebro medio ventral.
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Discussion
El sistema GIFM que hemos demostrado se puede utilizar para responder a una amplia gama de preguntas en una variedad de procesos celulares. Por ejemplo, los ratones diseñados con diferentes conductores de Cre puede ser utilizada para combatir cualquier tipo de célula, tejido o linaje genético de interés. Además, dado que el tamoxifeno puede ser administrada en cualquier punto del tiempo embrionario y postnatal, la recombinación puede dirigirse a cualquiera de las fases de desarrollo correspondientes. El control espacial y temporal de este sistema es ideal para investigar cómo las células que expresan genes particulares contribuyen a una estructura o una región de interés, así como la célula de eventos de migración y los patrones durante el desarrollo.
Además de simplemente marcar y visualizar las células mediante técnicas de inmunohistoquímica (Figura 1), la metodología GIFM se puede utilizar para una variedad de aplicaciones. Mediante la combinación de GIFM con un knock-out condicional alelo genético de pérdida de función puede ser temporal y espacialmente dirigida a las poblaciones de células relevantes, que son a la vez marcado con un alelo reportero. Por otra parte, los tejidos obtenidos de animales destino asignado se puede utilizar en combinación con la selección de células activadas por fluorescencia (FACS) para aislar físicamente las células que expresan los genes indicadores o marcadores particulares en distintas poblaciones. Marcado tejidos aislados durante la embriogénesis o de los animales adultos pueden ser cultivados, lo que permite la entrega de medicamentos o construcciones genéticas a los linajes definidos in vitro.
Nuestro laboratorio utiliza los resultados obtenidos de los estudios GIFM para ayudar a responder preguntas complejas que plantean las enfermedades neurológicas, tales como la enfermedad de Parkinson s, la esquizofrenia, el autismo y esclerosis tuberosa. Al comprender que las poblaciones de células se ven afectadas en cada una de estas enfermedades y cómo estas poblaciones cambian con el tiempo en modelos de ratón, esperamos entender mejor la patología observada e incluso plantean los medios posibles de tratamiento en la clínica.
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Disclosures
Todos los autores contribuyeron igualmente a este trabajo y están ordenados alfabéticamente. La contribución de cada individuo es evidente por su participación en el artículo de vídeo.
Acknowledgments
Damos las gracias a S. Arber para los ratones mGFP ya los miembros del laboratorio de Zervas que leer críticamente el papel y brindó asistencia técnica. A. Brown fue apoyado por una concesión de Ciencias del Cerebro de Verano de Investigación de Posgrado Kaplan. E. Normand fue apoyada por una ciencia del cerebro Premio de Investigación del Programa Graduado. Esta investigación también fue financiada por los fondos de investigación de inicio (MZ).
References
- Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system. Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
