Protein-Extraktion für Proteom-Analysen in Pilzarten erfordert ein hohes Maß an Standardisierung zu erfolgen gemäß den Mindestanforderungen Informationen über ein Proteom-Experiment (MIAPE) Richtlinien. Wir präsentieren ein Video-Protokoll, das ein Verfahren zur Minimierung der experimentellen Bias während Toxin Induktion und Extraktion der Proteine aus schließt<em> Fusarium spp.</em
Fusarien sind Fadenpilze in der Lage, verschiedene Toxine produzieren. Fusarium Mykotoxinen wie Deoxynivalenol, Nivalenol, T2, zearelenone, fusaric Säure, Moniliformin, etc. .. nachteilige Auswirkungen auf Mensch und Tier Gesundheit und einige werden als Pathogenitätsfaktoren angesehen. Proteomik-Studien erwies sich als wirksam zur Entschlüsselung Toxinproduktion Mechanismen (Taylor et al., 2008) sowie zur Identifizierung potentieller pathogenen Faktoren (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusarien. Es wird daher von grundlegender Bedeutung für zuverlässige Methoden für den Vergleich zwischen Proteom-Studien, um auf wahren Unterschiede in der Proteinexpression zwischen den Experimenten, Zerrungen und Labors gefunden verlassen zu etablieren. Das Verfahren, das beschrieben werden soll, um ein höheres Maß an Standardisierung der Proteom-Verfahren auf zwei Arten beitragen. Die gefilmten Protokoll wird verwendet, um das Niveau der Details, die genau beschrieben werden können, erhöht. Darüber hinaus bildet die Verfügbarkeit von standardisierten Verfahren zur Verarbeitung biologischer sollte eine höhere Robustheit der Daten zu gewährleisten, auch unter Berücksichtigung des menschlichen Faktors im Rahmen der technischen Reproduzierbarkeit der Extraktion.
Das beschriebene Protokoll benötigt 16 Tage für seine Fertigstellung: 14 Tage für Kulturen und zwei Tage für die Protein-Extraktion (Abbildung 1).
Kurz gesagt, Fusarium-Stämmen auf festen Medien für 4 Tage gewachsen, sie sind dann manuell fragmentiert und in eine modifizierte Toxin induziert Medien (Jiao et al, 2008.) Für 10 Tage. Myzel durch Filtration durch ein Miracloth Schicht gesammelt. Schleifen wird in einer Kältekammer durchgeführt. Verschiedene Betreiber durchgeführt Extraktion Wiederholungen (n = 3), um unter Berücksichtigung der Voreingenommenheit aufgrund technischer Veränderungen (Abbildung 2). Die Extraktion wurde auf einem SDS / DTT-Puffer wie in Taylor et al beschrieben ist. (2008) mit leichten Modifikationen. Insgesamt Proteinextraktion erforderte eine Fällung der Proteine mit Aceton / TCA / DTT-Puffer über Nacht und Aceton / DTT Waschen (Abbildung 3a, 3b). Die Proteine wurden schließlich in der Protein-Kennzeichnung Puffer resolubilisiert und quantifiziert. Die Ergebnisse der Extraktion wurden visualisiert auf einem 1D-Gel (Abbildung 4, SDS-PAGE), bevor Sie mit 2D-Gelen (IEF / SDS-PAGE). Das gleiche Verfahren kann für Proteom-Analysen auf anderen Kultursubstrate und andere Fadenpilze (Miles et al., 2007) angewendet werden.
Das gegenwärtige Interesse an Proteomik Ansätze innerhalb der Pilz-Biologie-Domain zu einer erhöhten Zahl von Veröffentlichungen mit dieser Technik (wie in Kim et al., 2007 reviewed) geführt. Verfahren zur Extraktion der Proteine setzen auf eine Kombination von Extraktionsverfahren, sie sind oft kaum in der methodischen Abschnitten beschrieben und erfordern Fachkenntnisse im Umgang mit den potentiellen Methoden zur Fehlerbehebung.
Wie bei anderen "omics" Ansätze, Standards für die Probe und Datenverarbeitung ist, um verlässliche wissenschaftliche Daten zu generieren unerlässlich. Außerdem Proben und Verfahren der Manipulation soll adäquat beschrieben werden, um gemeinsame Interpretation der Ergebnisse zwischen den verschiedenen "omics" Experimente erlauben. Dies wäre wichtig für eine optimale Nutzung Potentialität der Cross-Data-Mining in der Genomik, Proteomik, Metabolomik, … (Morrison et al., 2006). Minimum Informationen über ein Proteom-Experiment wurde ausgearbeitet und Arbeitsgruppen wurden eingerichtet, um alle Aspekte eines Experiments (Gel-Elektrophorese, Massenspektrometrie, Molekulare Wechselwirkungen, Protein Modifikationen, Proteomics Informatik, Sample Processing) zu bewältigen. Zur Zeit sind keine definierten Informationen finden Sie auf Probe Verarbeitungsverfahren. Angesichts der Bedeutung der Protein-Extraktions-Verfahren bei der Bestimmung der endgültigen Qualität der Proteom-Studien, um die Verfahren, dass die Standardisierung im Rahmen der MIAPE Richtlinien zu erhöhen (Taylor et al., 2007) implementieren können, haben wir vorgeschlagen, die Verwendung eines Video-Protokoll detailliert Probe Verarbeitung. Video Beschreibung von Experimenten kann wesentlich dazu beitragen, die Zahl der Informationen über die Probenaufbereitung, die in einer besseren Reproduzierbarkeit der "omics" Experimente (Pasquali, 2007) Ergebnis erhöhen können.
In der Tat ist die Reproduzierbarkeit in Labors eine Grundvoraussetzung, um die Gültigkeit Ergebnisse aus der Proteomik (http://www.fixingproteomics.org) zu gewährleisten. Verschiedenen Besetzungen und verschiedenen Betreibern Manipulation Proben: Das Kreuz-Labor-Reproduzierbarkeit wird durch zwei Faktoren beeinflusst.
In dem beschriebenen Protokoll, schlagen wir vor, führen biologische Replikate mit mehreren Betreibern (Abbildung 2 und Video), um die Zuverlässigkeit der Daten (dh technische Variation der Ergebnisse ist zu berücksichtigen) zu erhöhen.
Das Verfahren zur Extraktion der Proteine beschrieben wird, auf SDS und Heizung auf. Dies war bisher gezeigt, dass eine gute Reinheit und Menge der Proteine (Bridge 1996) zu gewährleisten. SDS mit kochendem gekoppelt löst die Zellwände, hydrophobe Proteine und verhindert die Bildung von Oligomeren, die abort Fällung von Proteinen. Boiling ermöglicht auch die Inaktivierung von Proteasen. Der gleiche Effekt wird auch durch EDTA, PMSF und komplette Mini-Protease-Inhibitor produziert. DTT entfernt Disulfidbrücken in und zwischen Proteinen erleichtern Protein Solubilisierung.
Um SDS vor IEF zu entfernen, sind Proteine, die durch Aceton / TCA / DTT gefällt. Darüber hinaus ermöglicht Aceton / TCA / DTT Niederschlag Entfernen einiger Schadstoffe wie Lipide, Nukleinsäuren, Salze und / oder Phenol-Verbindungen, wenn diese Verbindungen vorhanden sind. Wie SDS, verhindern, dass diese Moleküle eine gute Migration während IEF. Nach diesem Niederschlag, ist es notwendig, die ausgefallenen Proteine durch Aceton / DTT, zu waschen, um TCA zu entfernen, da es mit IEF stören können.
Eine gute Vorbereitung der Proben ist der Schlüssel zu guten Ergebnissen. Dafür ist es auch wichtig, um eine Verunreinigung von Proteinen aus dem Umfeld der Arbeit mit puderfrei Handschuhe und Respekt für eine gute Laborpraxis zu vermeiden. Aus technischer Sicht innerhalb der beschriebenen Protokoll werden die wichtigsten Schritte für den Erhalt ausreichender Menge und Reinheit von Proteinen in zwei Phasen. Erstens, die Schleif-Phase, in der völligen Zerstörung der Zelle ist von grundlegender Bedeutung, um Proteine Release, und zweitens, die Reinigung des gesamten Proteine, eine Phase umfasst die Entfernung von der Mehrheit der Lipide, DNA und andere Verunreinigungen, die mit der Migration der Proteine stören können.
Wir danken Servane Contal und Boris Untereiner für ihre technischen Beitrag leisten. Wir erkennen die Unterstützung der FNR "FUTOX"-Projekt.
Media and solutions
PDA: 39 g Potato Dextrose Agar (Difco); 1 L distilled water.
V8 agar: 200 ml V8 (campbell’s, USA), 2g CaCO3 (Sigma), 16g Agar (DIFCO), 800 ml distilled water
Toxin inducing media: 1g K2HPO4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4 7H2O, 10 mg FeEDTA, 2g L glutamic acid, 10g sucrose in 1L of distilled water.
Lysis Buffer:
100mL | Final concentration | ||
Tris-HCL pH8 | 5mL | 50mM | 1M |
SDS | 2g or 10mL | 2% | 20% |
DTT | 500mL | 10mM | 2M |
EDTA | 20mL | 0.1mM | 0.5M |
PMSF | 200mL | ||
Complete mini protease inhibitor | 1 tablet | ||
Water | Qsp |
Precipitation Buffer:
100mL | Final concentration | |
TCA | 20mL | 20% |
DTT | 0.1mL | 0.1% |
Aceton | Qsp |
Washing Buffer:
100mL | Final concentration | |
DTT | 0.1mL | 0.1% |
Aceton | 100mL |
Labelling Buffer (store at -18°C in small aliquots):
1mL | Final concentration | |
Urea | 140 mg | 7M |
Thiourea | 50 mg | 2M |
CHAPS | 40 mg | 4% |
Tris | 30 µL | 30 mM |
Water | 1 mL |