Estrazione di proteine per l'analisi proteomica di specie fungine richiede alti livelli di standardizzazione da realizzare in accordo con le informazioni minime su un esperimento di proteomica (MIAPE) le linee guida. Vi presentiamo un video-protocollo che prevede una procedura di minimizzazione pregiudizi sperimentale durante l'induzione della tossina e l'estrazione di proteine da<em> Fusarium spp.</em
Fusaria funghi filamentosi sono in grado di produrre tossine diverse. Micotossine del genere Fusarium, quali il deossinivalenolo, nivalenolo, T2, zearelenone, fusaric acido, moniliformina, ecc .. avere effetti nocivi sulla salute umana e animale e alcuni sono considerati come fattori di patogenicità. Studi di proteomica hanno mostrato di essere efficace per decifrare i meccanismi di produzione di tossine (Taylor et al., 2008) così come per identificare i fattori patogeni potenziali (Carta et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. Diventa quindi fondamentale stabilire metodi affidabili per il confronto tra gli studi di proteomica al fine di contare su vere differenze si trovano in espressione proteica tra esperimenti, ceppi e laboratori. La procedura che verrà descritta dovrebbe contribuire ad un aumento del livello di standardizzazione delle procedure di proteomica in due modi. Il protocollo girato è usato per aumentare il livello di dettagli che possono essere descritti con precisione. Inoltre, la disponibilità di procedure standardizzate di processo biologico replica dovrebbe garantire una robustezza maggiore di dati, tenendo conto anche del fattore umano all'interno della riproducibilità tecnica della procedura di estrazione.
Il protocollo descritto richiede 16 giorni per il suo completamento: quattordici giorni per le culture e due giorni per l'estrazione di proteine (figura 1).
In breve, i ceppi di Fusarium sono coltivate su terreni solidi per 4 giorni, sono poi manualmente frammentato e trasferito in un media tossina modificata indurre (Jiao et al, 2008.) Per 10 giorni. Micelio viene raccolto per filtrazione attraverso uno strato Miracloth. Rettifica è eseguita in una camera fredda. Diversi operatori effettuato l'estrazione repliche (n = 3) al fine di tener conto della distorsione dovuta a varianti tecniche (figura 2). L'estrazione è basata su un SDS / DTT tampone, come descritto nella Taylor et al. (2008) con lievi modifiche. Estrazione di proteine totali ha richiesto un processo di precipitazione delle proteine con Aceton / TCA / DTT lavaggio del buffer durante la notte e acetone / DTT (figura 3a, 3b). Proteine sono state finalmente resolubilized nella proteina di etichettatura buffer e quantificati. I risultati dell'estrazione sono stati visualizzati su un gel 1D (Figura 4, SDS-PAGE), prima di procedere alla 2D gel (IEF / SDS-PAGE). La stessa procedura può essere applicata per analisi proteomica su altri substrati di coltivazione e di altri funghi filamentosi (Miles et al., 2007).
Recente interesse per approcci di proteomica all'interno del dominio della biologia fungina ha portato ad un aumento del numero di pubblicazioni utilizzando questa tecnica (come recensione a Kim et al., 2007). Metodi per l'estrazione delle proteine si basano su una combinazione di procedure di estrazione, ma sono spesso scarsamente descritti nelle sezioni metodologiche e richiedono esperienza nel trattare con i metodi di risoluzione dei problemi potenziali.
Come per gli altri "omiche" si avvicina, definizione di standard per l'elaborazione dei campioni e dei dati è essenziale al fine di generare informazioni scientifiche affidabili. Inoltre i campioni e le procedure di manipolazione deve essere adeguatamente descritte in modo da consentire l'interpretazione risultato condiviso tra diversi "omiche" esperimenti. Questo sarebbe essenziale per sfruttare a pieno le potenzialità di cross-data mining nel campo della genomica, proteomica, metabolomica, … (Morrison et al., 2006). Informazioni minime su un esperimento di proteomica è stato redatto e gruppi di lavoro sono stati creati al fine di affrontare tutti gli aspetti di un esperimento (gel elettroforesi, spettrometria di massa, le interazioni molecolari, modifiche delle proteine, Informatica Proteomica, Sample Processing). Al momento non sono disponibili informazioni definite sulle procedure di trattamento del campione. Data l'importanza delle procedure di estrazione delle proteine nel determinare la qualità finale di studi di proteomica, al fine di attuare procedure che possono aumentare di normalizzazione nel quadro di linee guida MIAPE (Taylor et al., 2007), abbiamo proposto l'uso di un protocollo video detailing sample elaborazione. Descrizione del video di esperimenti possono contribuire ad aumentare considerevolmente il numero di informazioni sul trattamento dei campioni che possono risultare in una migliore riproducibilità dei "omiche" esperimenti (Pasquali, 2007).
Infatti, la riproducibilità attraverso laboratori è un requisito fondamentale per garantire la validità dei risultati proteomica (http://www.fixingproteomics.org). Il cross-laboratorio riproducibilità è influenzata da due fattori: strumentazioni differenti e differenti operatori manipolare campioni.
Nel protocollo descritto, ci proponiamo di svolgere biologici replica che coinvolge più operatori (Figura 2 e video) di aumentare l'affidabilità dei dati (cioè variazione tecnica dei risultati viene preso in considerazione).
La procedura descritta per l'estrazione di proteine si basa sulla scheda di sicurezza e riscaldamento. Ciò è stato già dimostrato di garantire una buona purezza e la quantità di proteine (Ponte 1996). SDS accoppiato con bollente si scioglie pareti delle cellule, delle proteine idrofobiche e previene la formazione di oligomeri che le precipitazioni abortire delle proteine. Ebollizione consente anche l'inattivazione delle proteasi. Lo stesso effetto viene prodotto anche con EDTA, PMSF e completa inibitore della proteasi mini. DTT rimuove ponti disolfuro tra le proteine e facilitare la solubilizzazione delle proteine.
Al fine di rimuovere SDS prima IEF, le proteine vengono precipitate con l'acetone / TCA / DTT. Inoltre, acetone / TCA / DTT precipitazioni permette la rimozione di alcuni contaminanti come i lipidi, acidi nucleici, i sali e / o composti fenolici, quando questi composti sono presenti. Come la SDS, queste molecole prevenire una migrazione bene durante IEF. A seguito di questa precipitazione, è necessario lavare le proteine precipitate con l'acetone / DTT, in modo da eliminare TCA in quanto può interferire con IEF.
Una buona preparazione del campione è la chiave per un buon risultato. Per questo, è anche essenziale per evitare la contaminazione delle proteine dall'ambiente di lavoro con i guanti senza polvere e nel rispetto buone pratiche di laboratorio. Da un punto di vista tecnico, all'interno del protocollo descritto, le fasi più critiche di ottenere quantità sufficienti e la purezza delle proteine sono due fasi. In primo luogo, la fase di macinazione, dove completa distruzione delle cellule è fondamentale per liberare le proteine, e la seconda, la purificazione di proteine totali, una fase che comprende la rimozione della maggior parte dei lipidi, DNA e altri contaminanti che potrebbero interferire con la migrazione delle proteine.
Ringraziamo Servane Contal e Boris Untereiner per il loro contributo tecnico. Riconosciamo l'appoggio di FNR progetto "FUTOX".
Media and solutions
PDA: 39 g Potato Dextrose Agar (Difco); 1 L distilled water.
V8 agar: 200 ml V8 (campbell’s, USA), 2g CaCO3 (Sigma), 16g Agar (DIFCO), 800 ml distilled water
Toxin inducing media: 1g K2HPO4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4 7H2O, 10 mg FeEDTA, 2g L glutamic acid, 10g sucrose in 1L of distilled water.
Lysis Buffer:
100mL | Final concentration | ||
Tris-HCL pH8 | 5mL | 50mM | 1M |
SDS | 2g or 10mL | 2% | 20% |
DTT | 500mL | 10mM | 2M |
EDTA | 20mL | 0.1mM | 0.5M |
PMSF | 200mL | ||
Complete mini protease inhibitor | 1 tablet | ||
Water | Qsp |
Precipitation Buffer:
100mL | Final concentration | |
TCA | 20mL | 20% |
DTT | 0.1mL | 0.1% |
Aceton | Qsp |
Washing Buffer:
100mL | Final concentration | |
DTT | 0.1mL | 0.1% |
Aceton | 100mL |
Labelling Buffer (store at -18°C in small aliquots):
1mL | Final concentration | |
Urea | 140 mg | 7M |
Thiourea | 50 mg | 2M |
CHAPS | 40 mg | 4% |
Tris | 30 µL | 30 mM |
Water | 1 mL |