Белки добычи для протеомных анализов в грибковых видов требует высокого уровня стандартизации быть выполнено в соответствии с минимальной информации о протеомных эксперимента (MIAPE) руководящих принципов. Мы представляем видео-протокол, который включает в себя процедуры для сведения к минимуму экспериментальные смещения во время индукции токсина и белка извлечения из<em> Fusarium sрр.</em
Fusaria являются нитчатые грибы способны производить различные токсины. Fusarium микотоксинами, такими как деоксиниваленол, nivalenol, T2, zearelenone, фузариевая кислоты, moniliformin, и т.д. .. оказать неблагоприятное воздействие на человека и животных здоровья и некоторые из них рассматриваются как факторы патогенности. Протеомных исследований показали свою эффективность для расшифровки токсина механизмов (Taylor и соавт., 2008), а также для выявления потенциальных патогенных факторов (бумага и соавт., 2007, Houterman и соавт., 2007) в Fusaria. Она становится таким образом фундаментальное значение для создания надежных методов для сравнения между протеомных исследований для того, чтобы полагаться на истинные различия, существующие в экспрессии белка среди экспериментов, деформаций и лабораторий. Процедура, которая будет описана должно способствовать повышению уровня стандартизации процедур протеомных двумя способами. Снят протокол используется для повышения уровня детали, которые могут быть описаны точно. Более того, наличие стандартных процедур для обработки биологических повторяет должно гарантировать более высокую надежность данных, а также с учетом человеческого фактора в рамках технической воспроизводимости процедуры извлечения.
Протокол, описанный требуется 16 дней для его завершения: четырнадцать дней для культур и двух дней для извлечения белка (рис. 1).
Короче говоря, Fusarium штаммы выращивают на твердой среде в течение 4 дней, они затем вручную фрагментирован и переданы в измененные токсины вызывающие СМИ (Jiao и др., 2008.) В течение 10 дней. Мицелий собираются путем фильтрации через Miracloth слоя. Шлифовальные выполняется в холодной камере. Различные операторы осуществляется добыча повторяет (п = 3) для того, чтобы учесть смещение из-за технических изменений (рисунок 2). Добыча была основана на SDS / DTT буфера, как описано в Taylor и соавт. (2008) с небольшими изменениями. Всего добыча белка требуется осадков процесс белков, используя ацетон / TCA / DTT буфера в ночное время и ацетон / DTT стиральной (рис. 3а, 3б). Белки были, наконец, resolubilized в белке маркировки буфера и количественно. Результаты добычи были визуализированы на 1D гель (рис. 4, SDS-PAGE), прежде чем перейти к 2D гелей (МЭФ / SDS-PAGE). Аналогичная процедура может быть применена для анализа протеомных на других растущих средств массовой информации и других мицелиальных грибов (Miles и соавт., 2007).
Недавний интерес в протеомных подходов в области биологии грибковых привело к увеличению числа публикаций с помощью этой техники (как рассматривается в Ким и соавт., 2007). Методы извлечения белка полагаться на сочетание добычи процедур; они часто почти не описано в методологической секции и требуют опыта в работе с потенциальными способы устранения неполадок.
Что касается других "omics" подходов, установление стандартов для обработки образцов и данных необходима в целях получения достоверной научной информации. Более того образцов и процедуры манипуляции должны быть адекватно описана в целях обеспечения общей интерпретации результатов между различными "omics" экспериментов. Это было бы необходимо для полного использования потенциальной перекрестного анализа данных в области геномики, протеомики, метаболомики, … (Morrison и соавт., 2006). Минимальная информация о протеомных эксперимента была разработана и рабочие группы были созданы для того, чтобы решать все аспекты эксперимента (гель-электрофореза, масс-спектрометрия, молекулярных взаимодействий, белки Изменения, протеомика информатики, обработки образцов). На данный момент не определена информацию можно найти на процедуры обработки образцов. Учитывая важность процедуры извлечения белка при определении окончательного качества протеомных исследований, для того, чтобы внедрить процедуры, которые могут увеличить стандартизации в рамках MIAPE руководящие принципы (Taylor и соавт., 2007), мы предложили использовать видео-протокол подробным образца обработки. Видео описание экспериментов могут внести существенный вклад в увеличение количества информации по обработке образцов, которые могут привести к улучшению воспроизводимости "omics" эксперименты (Pasquali, 2007).
В самом деле, воспроизводимость между лабораториями является фундаментальным требованием, чтобы гарантировать справедливость протеомики результаты (http://www.fixingproteomics.org). Кросс-лаборатория воспроизводимость находится под влиянием двух факторов: различных измерительных приборов и различных операторов манипулирования образцами.
В описанном протоколе, мы предлагаем выполнить биологическую повторяет с участием нескольких операторов (рис. 2 и видео) с целью повышения надежности данных (т.е. технические изменения результатов учитывается).
Процедуре, описанной для извлечения белка основана на SDS и отопления. Это было показано ранее, чтобы гарантировать чистоту и хорошее количество белков (Bridge 1996). SDS в сочетании с кипящей растворяет клеточные стенки, гидрофобными белками и предотвращает образование олигомеров, что прервать осаждение белков. Кипение позволяет также инактивация протеаз. Тот же эффект возникает также ЭДТА, PMSF и полный мини-ингибитор протеазы. DTT удаляет дисульфидные мостики в белках, а также между облегчения солюбилизации белка.
Для того, чтобы удалить SDS до МЭФ, белки осаждают ацетоном / TCA / DTT. Кроме того, ацетон / TCA / DTT осадков позволяет удалить некоторые загрязняющие вещества, такие как липиды, нуклеиновые кислоты, соли и / или фенольные соединения, когда эти соединения присутствуют. Как SDS, эти молекулы предотвратить хорошей миграции в МЭФ. Вслед за этим осадков, необходимо мыть осаждают белки ацетоном / DVB-T, для того, чтобы удалить TCA так как он может вмешиваться в МЭФ.
Хорошая подготовка образца ключом к хорошим результатам. Для этого необходимо также, чтобы избежать загрязнения белков из рабочей среды с неопудренные перчатки и уважение надлежащей лабораторной практики. С технической точки зрения, в рамках описанного протокола, наиболее важных шагов для получения достаточного количества и чистоты белков два этапа. Во-первых, шлифовальные фазу, где полное уничтожение клетка имеет основополагающее значение для выпуска белков, во-вторых, очистка от общего числа белков, фаза охватывает удаления большинства липидов, ДНК и других загрязняющих веществ, которые могут помешать миграции белков.
Мы благодарим Servane Contal и Борис Untereiner для их технического вклада. Мы признаем, поддержка ФНР "FUTOX" проекта.
Media and solutions
PDA: 39 g Potato Dextrose Agar (Difco); 1 L distilled water.
V8 agar: 200 ml V8 (campbell’s, USA), 2g CaCO3 (Sigma), 16g Agar (DIFCO), 800 ml distilled water
Toxin inducing media: 1g K2HPO4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4 7H2O, 10 mg FeEDTA, 2g L glutamic acid, 10g sucrose in 1L of distilled water.
Lysis Buffer:
100mL | Final concentration | ||
Tris-HCL pH8 | 5mL | 50mM | 1M |
SDS | 2g or 10mL | 2% | 20% |
DTT | 500mL | 10mM | 2M |
EDTA | 20mL | 0.1mM | 0.5M |
PMSF | 200mL | ||
Complete mini protease inhibitor | 1 tablet | ||
Water | Qsp |
Precipitation Buffer:
100mL | Final concentration | |
TCA | 20mL | 20% |
DTT | 0.1mL | 0.1% |
Aceton | Qsp |
Washing Buffer:
100mL | Final concentration | |
DTT | 0.1mL | 0.1% |
Aceton | 100mL |
Labelling Buffer (store at -18°C in small aliquots):
1mL | Final concentration | |
Urea | 140 mg | 7M |
Thiourea | 50 mg | 2M |
CHAPS | 40 mg | 4% |
Tris | 30 µL | 30 mM |
Water | 1 mL |