Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen
Summary
Drosophila Blutzellen über die Gesamtheit des sich entwickelnden Embryos zu zerstreuen. Dieses Protokoll zeigt, wie die Montage und Bild dieser Migrationen Verwendung von Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Blutzellen.
Abstract
Viele Studien befassen sich mit der Zellwanderung<em> In-vitro-</em> Methoden, während die physiologisch relevanten Umwelt ist, dass der Organismus selbst. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Montage von<em> Drosophila melanogaster</em> Embryonen und anschließender Live-Darstellung von fluoreszenzmarkierten Blutzellen, die embryonale Makrophagen dieses Organismus. Mit dem Gal4-UAS-System<sup> 1</sup> Fahren wir die Expression einer Vielzahl von genetisch kodierten, fluoreszenzmarkierten Marker in Blutzellen, ihre Entwicklungs-Verbreitung in den Embryo zu folgen. Nach dem Sammeln von Embryonen in der gewünschten Ausbaustufe ist die äußere Chorion entfernt und die Embryonen werden dann in Halocarbonöl zwischen einem hydrophoben, Gas-Membran und einem Deckglas für Live-Bildgebung montiert. Zusätzlich zu grob wandernde Parameter wie Geschwindigkeit und Ausrichtung, höhere Auflösung Bildgebung mit der Verwendung von fluoreszierenden Reporter von F-Aktin und Mikrotubuli Nähere Informationen über die Dynamik dieser Zytoskelett-Komponenten bieten gekoppelt.
Protocol
Discussion
Die wichtigsten Elemente dieses Verfahrens sind die Auswahl gesunder Embryonen mit deutlich gekennzeichneten Blutzellen und sie vorsichtig montieren, ohne sie zu beschädigen. Sobald die Embryonen in die Halocarbonöl sind, sind sie resistent gegen Austrocknung und einmal montiert werden kann für mehrere Stunden abgebildet werden. In unseren Händen können wir Bild Blutzellen für drei Stunden, mit vernachlässigbarer Austrocknung des Embryos oder offensichtliche Foto-Schäden, wobei ein z-Stapel von Bildern alle drei…
Acknowledgements
Dieses Protokoll wurde durch unsere Arbeit im und in Zusammenarbeit mit den Labors von Paul Martin und Antonio Jacinto entwickelt. Wir danken der Bloomington Lager Zentrums für seinen ausgezeichneten Service und die Drosophila-Community für die Weiterbildung zu fliegen Linien teilen. BS wird derzeit von einer BBSRC Projektförderung finanziert. WW wird durch eine Wellcome Trust Career Development Fellowship gefördert.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell strainer | BD Falcon | 352350 | 70μm pores | |
| Halcarbon oil 700 | Sigma | H8898 | ||
| Lumox/Petriperm dish | Sarstedt | 96077305 |
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