Summary
يصف هذا البروتوكول إنتاج tetramer KLRG1 ، الذي هو أداة قوية لتحليل KLRG1 يغاندس.
Abstract
قاتل مستقبلات الخلية G1 lectin مثل (KLRG1) هي عبر الغشاء مستقبلات بروتين سكري من النوع الثاني المثبطة ينتمون إلى الفصيلة C lectin تشبه النوع. KLRG1 موجود بوصفه على حد سواء ونتيجة لمونومر homodimer ثاني كبريتيد مرتبطة. تم العثور على هذه المستقبلات جيدا الحفاظ على خلايا NK الأكثر نضجا وتفعيلها مؤخرا فضلا عن مجموعة فرعية من خلايا تي المستجيب / الذاكرة.
باستخدام KLRG1 tetramer فضلا عن أساليب أخرى ، E ، N ، وحددت R - cadherins كما KLRG1 يغاندس. هذه كا + التي تعتمد على خلية خلية التصاق جزيئات تتكون من خارج الخلية التي تحتوي على مجال يكرر كادهيرين الخمسة المسؤولة عن الخلية الخلية والتفاعلات ، ومجال وعبر الغشاء مجال هيولي مرتبط إلى الهيكل الخلوي أكتين 2
وكان جيل من tetramer KLRG1 ضرورية لتحديد يغاندس KLRG1. KLRG1 tetramer هو أيضا أداة فريدة لإلقاء الضوء على الأدوار واللعب كادهيرين KLRG1 في تنظيم الاستجابة المناعية وسلامة الأنسجة.
Protocol
إعداد الأجهزة إدراج
- تطعيم 4 × 500 مل من السل قوارير تحتوي كل منها على 50 ميكروغرام / مل من كربنيسيلين والكلورامفينيكول مع الثقافة بين عشية وضحاها من البكتيريا معربا عن بناء KLRG1 البلازميد. عندما تصل إلى 0.6 Å OD في 600 نانومتر ، وتحدث مع إضافة IPTG M 0.4 و احتضان الثقافة للحصول على 4 ساعات اضافية تهتز عند 37 درجة مئوية.
- Resuspend حصاد الخلايا في درجة الحموضة عازلة إعادة تعليق = 8.0 (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، و 25 ٪ (W / V) السكروز ، 1 ملم EDTA ، 10 ملي DTT). ملاحظة : يمكن تجميد الكريات في هذه المرحلة.
- تجمع ما لا يزيد عن 60 مل من resuspensions الجرثومي في دورق البولي بروبلين. إذا كان ذلك ضروريا لضبط 60 مل مع الشركة المصرية للاتصالات 8.0 درجة الحموضة عازلة ويحرك الخليط بنصف السرعة.
- إضافة إلى إثارة مزيج قطرة الحكمة : الليزوزيم (النهائي = 1 ملغ / مل) ، MgCl2 (النهائي = 5 ملم) ، 2 ملغ الدناز كنت في الجلسرين 50 ٪ الواردة 75 مم كلوريد الصوديوم ، تريتون - X100 (النهائي = 1 ٪) ، DTT ( النهائي = 10 ملم).
- يصوتن الحل على الثلج لمدة 1.5 دقيقة ، وأجهزة الطرد المركزي في 5000 دورة في الدقيقة في lysates لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- صب وطاف.
- إضافة 15 مل من الحموضة عازلة غسل = 8.0 (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، و 0.5 ٪ تريتون X - 100 ، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ، EDTA 1 ملم ، 1 ملم DTT).
- على الجليد ، ويصوتن حل ل1.5 دقيقة حتى يتم معلق تماما بيليه.
- العينات في جهاز الطرد المركزي 5000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- كرر 5 مرات الغسيل.
- 5B مع تكرار غسل العازلة دون الطرد المركزي تريتون ، X - 100 وresuspend في 4 مل من مخزن الشركة المصرية للاتصالات.
- أخذ الوزن الرطب إدراج الهيئات الطين وتخزينها في المخزن TE بتركيز من 30 إلى 100 ملغ / مل.
Refolding من KLRG1
- جعل 1 لتر من الحموضة refolding العازلة = 8.0 (0.4 - M ارجينين حمض الهيدروكلوريك و 0.1 درجة الحموضة 8-8،3 M تريس ، EDTA 2 ملم ، 0.2 ملم PMSF ، 3 EDTA خالية اقراص مثبطات الأنزيم البروتيني ، 5 و 0.5 ملي GSH GSSG ملم) والبرد إلى 4 درجات مئوية مع التحريك.
- إعداد الهيئات إدراج للحقن في الخليط للطي : وهي مثالية لجعل 5 10 الحقن مع كل تركيز 0.25 ميكرومتر 0.5 بحيث تركز النهائي من البروتين سوف يكون 2 3 ميكرومتر.
- تذوب حجم 50 ملغ من الطين الهيئات إدراجها في GnHCl M 7 مع 10 ملي β - المركابتويثانول.
- الحفاظ على إدراج الهيئات / خليط GnHCl عند 37 درجة مئوية لمدة 30-40 دقيقة ودوامة كل 5 دقائق لضمان انصهار كامل (الطين سيتضح عندما ذابت تماما).
- أجهزة الطرد المركزي بسرعة قصوى لمدة 30 دقيقة في microcentrifuge عند 4 درجة مئوية ، وطاف لنقل أنبوب الطرد المركزي 15 مل. لا لنقل أي من بيليه ومسود الصغيرة.
- ضبط حجم المخزن المؤقت مع حقن (3 M GnHCl ، 10 NaAcetate ملي ، ودرجة الحموضة 4.2،10 ملي EDTA).
- حقن 1 مل من الهيئات إدراج المخفف كل ساعة. عندما بالحقن ، ويحرك بسرعة عالية ، إضافة 1 مل من المخفف إدراج الهيئات قطرة قطرة مع 2 ثانية بين كل قطرة. عندما يتم حقن ويحرك بسرعة منخفضة.
- يستمر التحريك بين عشية وضحاها على سرعة منخفضة في 4 درجات مئوية.
تركيز ردود الفعل Refolding
- بعد بروتوكول ميليبور ق ، والتركيز على رد الفعل L 1 (0.22 ميكرون تصفية) قبل تصفيتها refolding باستخدام خلية وحرك Amicon YM10 الفائق 10K NMWL غشاء (ميليبور) إلى 10 مل ~.
- التركيز على 2 مل ≤ باستخدام Centriplus YM - 10 10K MWCO (ميليبور).
تنقية tetramer KLRG1
- الإعداد AKTAFPLC في 4 درجات مئوية وفقا للأدلة الرعاية الصحية GE.
- تنقية شكل من مونومر KLRG1 بواسطة اللوني استبعاد حجم باستخدام Sephacryl S - 200 16/60 عالية الدقة العمود (جنرال الكتريك للرعاية الصحية) في HEPES ملي 20 و 150 مم كلوريد الصوديوم. (أنظر الشكل 1).
- التركيز إلى 1 مل باستخدام Centriplus YM - 10 10K MWCO (ميليبور).
- استخدام انزيم البيرا وفقا لبروتوكول الطمع s لbiotinylate المونمر KLRG1.
- يتم التخلص من البيوتين مجانا من حجم الاستبعاد اللوني كما في 2.
- هو tetramerized KLRG1 جزيء عن طريق خلط KLRG1 مونومر مع 4 أضعاف المولي streptavidin PE الزائدة مترافق دينار بحريني (العلوم البيولوجية).
ممثل النتائج
refolded الشكل 1. نتائج إيجابية من الممثل اللوني FPLC AKTA استبعاد حجم KLRG1. ويبين الرسم البياني انفصال الأحادي (83.52 مل) ، ديمر (56.36 مل) ، وmultimer (36.26 مل) شكل KLRG1 refolded. في ذروة 94.25 مل يمثل تبادل العازلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول ، فإنه يظهر كيفية تنقية ، biotinylate وKLRG1 tetramerize. يمكن أن تستخدم لتسمية KLRG1 tetramer KLRG1 يغاندس بواسطة التدفق الخلوي. على الرغم من الظروف refolding سيتعين اختبارها تجريبيا لكل من البروتين ، يمكن tetramerized غيرها من نوع C - lectins باستخدام بروتوكول مماثل. ويمكن استخدام البروتينات tetramerized وتحقيقات ، يغاندس لمستقبلات اليتيم lectin نوع C - يحتمل أن يتم التعرف عليها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر الدكتور Naidenko للمساعدة في تحسين ظروف refolding. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة AI58181 منح البحوث لوران Brossay. سيندي تيا بانه معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة NRSA AI080230 F31.
ستيفاني Terrizzi تيا بانه وسيندي أيضا أن تساهم في هذا العمل.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche Group | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | EMD Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | EMD Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | EMD Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
- Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
- Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition. Immunity. 31, 35-46 (2009).
- Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.
