Summary
Ce protocole décrit la production de KLRG1 tétramère, qui est un outil puissant pour l'analyse des KLRG1 ligands.
Abstract
Récepteurs des cellules tueuses G1 lectine-like (KLRG1) est un récepteur de type II glycoprotéine transmembranaire inhibiteurs appartenant au type C de type lectine superfamille. KLRG1 existe à la fois comme un monomère et comme un homodimère ponts disulfure. Ce récepteur est bien conservé se trouve sur la plupart des cellules matures et récemment NK activées ainsi que sur un sous-ensemble de lymphocytes T effecteurs / mémoire.
Utiliser KLRG1 tétramère ainsi que d'autres méthodes, E, N, et R-cadhérines ont été identifiés comme KLRG1 ligands. Ces Ca 2 + cellulaire dépendante des molécules d'adhésion cellulaire comprend un domaine extracellulaire contenant cinq répète cadhérine responsable des interactions cellule-cellule, un domaine transmembranaire et un domaine cytoplasmique qui est liée au cytosquelette d'actine.
Génération du tétramère KLRG1 était essentielle pour l'identification des ligands KLRG1. KLRG1 tétramère est également un outil unique pour élucider la cadhérine rôles et jouer dans la régulation de KLRG1 la réponse immunitaire et l'intégrité des tissus.
Protocol
Préparation de corps d'inclusion
- Inoculer 4 x flacons de 500 ml de tuberculose chaque contenant 50 pg / ml de chloramphénicol et de carbénicilline avec une culture de nuit de bactéries exprimant la construction KLRG1 plasmide. Lorsque la DO atteint 0,6 A à 600 nm, induire avec l'ajout de 0,4 M IPTG et incuber la culture pour 4 heures supplémentaires d'agitation à 37 ° C.
- Resuspendre les cellules récoltées dans le pH tampon de resuspension = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 25% (p / v) de saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Remarque: Les granulés peuvent être congelés à ce stade.
- Piscine pas plus de 60 ml de remises en suspension bactérienne dans un bécher en polypropylène. Si nécessaire, ajuster à 60 ml avec du tampon TE pH 8,0 et remuer le mélange à demi-vitesse.
- Pour en remuant le mélange ajoutez goutte à goutte: le lysozyme (finale = 1 mg / ml), MgCl2 (finale = 5 mm), 2 mg DNAse I dans le glycérol à 50% contient 75 mM de NaCl, Triton-X100 (finale = 1%), TNT ( final = 10 mM).
- Soniquer la solution sur la glace pendant 1,5 min et centrifuger les lysats à 5000 rpm pendant 10 min à 4 ° C.
- Décanter le surnageant.
- Ajouter 15 ml de tampon de lavage pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 0,5% de Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
- Sur la glace, soniquer solution pour 1,5 min jusqu'à ce que la pastille est complètement remis en suspension.
- Centrifuger les échantillons à 5000 rpm pendant 10 min à 4 ° C.
- Répétez le lavage 5 fois.
- Répétez 5b avec un tampon de lavage sans Triton X-100, centrifugeuse et remettre en suspension dans 4 ml de tampon TE.
- Prenez l'inclusion poids humide des organes boue et de stocker dans un tampon TE à une concentration de 30 à 100 mg / ml.
Repliement des KLRG1
- Faire 1 L de repliement tampon pH = 8,0 (0,4 M arginine-HCl, 0,1 M Tris pH 8 à 8,3, EDTA 2 mM, 0,2 mM PMSF, 3 EDTA sans comprimés inhibiteur de la protéase, 5 GSH mM et 0,5 mM GSSG) et le froid à 4 ° C tout en remuant.
- Préparer le corps d'inclusion pour l'injection dans le mélange de pliage: Il est idéal pour faire 5 10 injections chacun avec 0,25 0,5 uM de concentration de telle sorte que la concentration finale de la protéine sera 2 3 uM.
- Faire fondre le volume de 50 mg de corps d'inclusion dans la boue 7 M GnHCl avec 10 mM de β-mercaptoéthanol.
- Gardez à l'inclusion des organismes / mélange GnHCl à 37 ° C pendant 30 - 40 min et le vortex toutes les 5 min pour assurer une fusion complète (lisier deviendra clair quand il est complètement fondu).
- Centrifugeuse à vitesse max pendant 30 min dans microcentrifugeuse à 4 ° C et le transfert du surnageant dans un tube à centrifuger de 15 ml. Ne pas transférer toute la petite pastille noirâtre.
- Régler le volume avec le tampon d'injection (3 M GnHCl, 10 NaAcetate mM, pH 4.2,10 mM EDTA).
- Injecter 1 ml de corps d'inclusion diluée à chaque heure. Lors de l'injection, mélanger à haute vitesse, ajouter 1 ml de corps d'inclusion déposer diluée à goutte avec 2 secondes entre chaque goutte. Lorsque l'injection est faite, mélanger à basse vitesse.
- Continuer nuit d'agitation à basse vitesse à 4 ° C.
Concentration des réactions Repliement
- Après le protocole Millipore s, concentrer la L 1 du pré-filtrée (0,22 um filtrée) la réaction de repliement en utilisant une cellule agitée Amicon YM10 et la membrane d'ultrafiltration NMWL 10K (Millipore) à ~ 10 ml.
- Concentré à ≤ 2 ml en utilisant un Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
Purification de KLRG1 tétramère
- Configuration du AKTAFPLC à 4 ° C, selon GE Healthcare manuels.
- Purifier la forme monomère du KLRG1 par chromatographie d'exclusion stérique en utilisant un Sephacryl S-200 à haute résolution 16/60 colonne (GE Healthcare) dans HEPES 20 mM et 150 mM de NaCl. (Voir figure 1).
- Concentré à 1 ml en utilisant Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
- Utilisez l'enzyme BirA conformément au protocole d'avidité s biotinyler le monomère KLRG1.
- La biotine libre est éliminé par chromatographie d'exclusion stérique comme dans 2.
- KLRG1 molécule est tetramerized en mélangeant KLRG1 monomère avec 4 fois molaire supérieure streptavidine conjuguée PE (BD Biosciences).
Les résultats représentatifs
Figure 1. Représentant des résultats positifs de la chromatographie d'exclusion stérique AKTA FPLC de l'repliée KLRG1. Le graphique montre la séparation du monomère (83,52 ml), dimère (56,36 ml), et multimère (36,26 ml) sous forme de KLRG1 repliée. Le pic à 94,25 ml représente l'échange de tampon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans ce protocole, il est montré comment purifier, biotinyler et KLRG1 tetramerize. KLRG1 tétramère peut être utilisé pour étiqueter KLRG1 ligands par cytométrie en flux. Bien que les conditions de repliement devra être testé empiriquement pour chaque protéine, d'autres lectines de type C pourrait être tetramerized utilisant un protocole similaire. En utilisant des protéines tetramerized comme sondes, des ligands de récepteurs orphelin lectine de type C pourrait potentiellement être identifiés.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Naidenko pour les aider à optimiser les conditions de repliement. Ce travail a été soutenu par le NIH recherche AI58181 accorder à Laurent Brossay. Cindy Banh est soutenu par les NIH NRSA F31 AI080230.
Stephanie Terrizzi et Cindy Banh contribuent également à ce travail.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche Group | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | EMD Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | EMD Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | EMD Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
- Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
- Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition. Immunity. 31, 35-46 (2009).
- Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.
