פרוטוקול לייצור KLRG1 Tetramer

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ייצור KLRG1 tetramer, אשר הוא כלי רב עוצמה לניתוח KLRG1 ligands.

Abstract

תא רוצח לקטינים כמו קולטן ה-G1 (KLRG1) הוא סוג II הטרנסממברני גליקופרוטאין קולטן מעכבות השייכים superfamily לקטינים כמו סוג ג'. KLRG1 קיים הן מונומר וכן homodimer דיסולפיד צמודות. קולטן זה היטב נשמרת נמצא על תאים NK בוגרת ביותר הופעל לאחרונה, כמו גם על קבוצת תאים T מפעיל / זיכרון.

שימוש KLRG1 tetramer כמו גם שיטות אחרות, דואר, N-, ו-R-cadherins זוהו KLRG1 ligands. אלה Ca ^{2 +} תלויי תאים תאים מולקולות הדבקה כוללת של תחום תאי המכיל חמש חזרות cadherin אחראי תאים תאים אינטראקציות, תחום הטרנסממברני ואת תחום cytoplasmic המקושר cytoskeleton אקטין.

הדור של tetramer KLRG1 היה חיוני לזיהוי של KLRG1 ligands. KLRG1 tetramer היא גם כלי ייחודי כדי להבהיר את cadherin תפקידים לשחק KLRG1 בוויסות התגובה החיסונית ושלמות הרקמות.

Protocol

הכנת גופים הכללה

1. לחסן 4 x 500 מ"ל צלוחיות של שחפת שכל אחת מהן מכילה 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו carbenicillin chloramphenicol עם תרבות הלילה של חיידקים ביטוי לבנות KLRG1 פלסמיד. כאשר מגיע OD 0.6 בבית 600 ננומטר, להשרות עם תוספת של 0.4 M ו - IPTG דגירה והתרבות של 4 שעות נוספות רועד ב 37 ° C.
2. Resuspend התאים שנקטפו ב-pH = 8.0 חיץ resuspension (50 מ"מ טריס-HCl, 25% (W / V) סוכרוז, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). הערה: כדורי אפשר להקפיא בשלב זה.
3. בריכת לא יותר מ 60 מ"ל של חיידקי resuspensions בכוס פוליפרופילן. אם יש צורך להסתגל 60 מ"ל עם TE חיץ pH 8.0 ומערבבים לתערובת במהירות וחצי.
4. כדי בחישה לתערובת להוסיף טיפה חכם: ליזוזים (סופי = 1 מ"ג / מ"ל), MgCl2 (סופי = 5 מ"מ), 2 מ"ג DNAse אני ב גליצרול 50% הכילו 75 mM NaCl, טריטון-X100 (סופי = 1%), DTT ( סופי = 10 mM).
5. Sonicate הפתרון על קרח דק 1.5 ו בצנטריפוגה lysates ב 5000 סל"ד במשך 10 דקות ב 4 ° C.
   1. למזוג supernatant.
   2. הוסף 15 מ"ל של pH = 8.0 חיץ לשטוף (50 מ"מ טריס-HCl, 0.5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
   3. על קרח, sonicate פתרון 1.5 דקות עד גלולה הוא resuspended לחלוטין.
   4. צנטריפוגה דגימות ב 5000 סל"ד במשך 10 דקות ב 4 ° C.
   5. חזור על לשטוף 5 פעמים.
6. חזור 5b עם חיץ לשטוף ללא צנטריפוגות טריטון, X-100 ו resuspend ב 4 מ"ל של הצפת TE.
7. קח את משקל רטוב הכללת גופים slurry ולאחסן TE חיץ בריכוז של 30 עד 100 מ"ג / מ"ל.

Refolding של KLRG1

1. הפוך את L 1 של refolding pH = 8.0 חיץ (0.4 מ 'ארגינין-HCl, 0.1 מ' טריס pH 8-8.3, 2 mM EDTA, 0.2 מ"מ PMSF, 3 EDTA ללא מעכבי פרוטאז טבליות, GSH 5 מ"מ GSSG 0.5 מ"מ) צמרמורת עד 4 ° C תוך ערבוב.
2. הכן את הגופות הכללת להזרקה לתוך תערובת קיפול: הוא אידיאלי לעשות 5 10 זריקות כל אחד עם ריכוז 0.5 0.25 מיקרומטר, כך הריכוז הסופי של החלבון יהיה 2 3 מיקרומטר.
   1. ממיסים את נפח של 50 מ"ג של slurry הכללת גופים 7 M GnHCl עם 10 מ"מ β-mercaptoethanol.
   2. שמור את הכללת גופים / תערובת GnHCl על 37 מעלות צלזיוס למשך 3-40 דק 'ו מערבולת כל 5 דקות כדי להבטיח התכה מלאה (slurry יתברר כאשר נמס לחלוטין).
   3. צנטריפוגה במהירות מקסימום למשך 30 דקות ב microcentrifuge ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. אין להעביר כל אחד גלולה שחור קטן.
3. כוונן את עוצמת הקול עם חיץ הזרקה (3 M GnHCl, NaAcetate 10 מ"מ, ה-pH 4.2,10 mM EDTA).
4. הזרק 1 מ"ל של גופים הכללת מדולל כל שעה. כאשר מזריקים, מערבבים במהירות גבוהה, מוסיפים 1 מ"ל של ירידה הכללת גופים מדולל עם ירידה של 2 שניות בין כל טיפה. כאשר מתבצעת הזרקה, ומערבבים במהירות נמוכה.
5. המשך לילה ערבוב במהירות נמוכה ב 4 ° C.

ריכוז תגובות שב וקיפל

1. בעקבות פרוטוקול של Millipore, לרכז את L 1 של התגובה (0.22 מיקרומטר מסונן) מראש מסונן refolding באמצעות Amicon מעורבב תא YM10 קרום 10K NMWL ultrafiltration (Millipore) ל ~ 10 מ"ל.
2. להתרכז כדי מ"ל 2 ≤ באמצעות Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).

טיהור KLRG1 tetramer

1. הגדרת AKTAFPLC על 4 מעלות צלזיוס על פי הוראות GE Healthcare.
2. לטהר את הטופס מונומר של KLRG1 ידי כרומטוגרפיה גודל הרחקה באמצעות Sephacryl S-200 16/60 ברזולוציה גבוהה עמודה (GE Healthcare) ב 20 HEPES מ"מ ו 150 מ"מ NaCl. (ראה תרשים 1).
3. להתרכז כדי מ"ל 1 באמצעות Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
4. השתמש אנזים בירה על פי פרוטוקול של בלהיטות כדי biotinylate מונומר KLRG1.
5. ביוטין חינם מסולק על ידי כרומטוגרפיה הדרה גודל כמו 2.
6. KLRG1 מולקולה היא tetramerized ידי ערבוב KLRG1 מונומר עם 4 לקפל טוחנת עודף PE streptavidin מצומדות (BD Biosciences).

נציג תוצאות

באיור 1. תוצאות חיוביות נציג מן כרומטוגרפיה FPLC אקטע גודל הרחקה של וקיפלתי KLRG1. הגרף מראה את ההפרדה של מונומר (83.52 מ"ל), דימר (56.36 גרם), ו multimer (36.26 מ"ל) טופס של KLRG1 וקיפלתי. לשיא מ"ל 94.25 מייצג את חילופי חיץ.

Discussion

בפרוטוקול זה, הראה כיצד לטהר, biotinylate ו KLRG1 tetramerize. KLRG1 tetramer ניתן להשתמש בתווית KLRG1 ligands ידי cytometry הזרימה. למרות התנאים refolding יצטרך להיבדק באופן אמפירי של חלבון זה לזה, C-סוג לקטינים יכול להיות tetramerized באמצעות פרוטוקול דומה. באמצעות חלבונים tetramerized כמו בדיקות, ligands ל-C מסוג קולטני יתום לקטינים שעלולים להיות מזוהה.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
BirA Enzyme and Buffer	Biotinylation Kit	Avidity	BIRA500
Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free	Reagent	Roche Group	11 836 170 001	or equivalent
Amicon Stirred Cell	Equipment	EMD Millipore	Model #8400	or equivalent
YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane	Filtration Supply	EMD Millipore	13642
15 ml YM10 concentrator	Filtration Supply	EMD Millipore	4411
AKTAFPLC	Equipment	GE Healthcare	18-1900-26
Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column	Equipment	GE Healthcare	17-1166-01
Strepavidin PE	Reagent	BD Biosciences	554061	or equivalent