Summary
이 프로토콜은 KLRG1 리간드의 분석을위한 강력한 도구입니다 KLRG1 tetramer의 생산을 설명합니다.
Abstract
킬러 세포 렉틴 같은 수용체 G1 (KLRG1)은 C 타입 렉틴 같은 superfamily에 속하는 유형 II의 transmembrane의 당단백질 수용체 억제합니다. KLRG1는 단량체로서 이황화 결합 homodimer로 모두 존재합니다. 이 잘 보존되어 수용체가 가장 성숙하고 최근에 활성화된 NK 세포에서뿐만 아니라 효과기 / 메모리 T 세포의 일부에서 발견됩니다.
KLRG1 tetramer뿐만 아니라 다른 방법을 사용하여, E -, N - 및 R - cadherins은 KLRG1 리간드로 확인되었습니다. 이러한 칼슘 2 +에 의존 세포 - 세포 부착 분자는 세포 - 세포 상호 작용, transmembrane 도메인과 굴지의 cytoskeleton에 연결된 세포질 도메인에 대해 책임을 다섯 cadherin의 반복을 포함하는 세포외 도메인에 구성되어 있습니다.
KLRG1 tetramer의 생성은 KLRG1 리간드의 식별에 필수되었습니다. KLRG1 tetramer 또한 면역 반응 및 조직 무결성을 규제의 역할 cadherin과 KLRG1 재생을 명료하게하다 수있는 유일한 도구입니다.
Protocol
포함 기관의 준비
- TB 4 X 500 ML flasks의 예방 각각 KLRG1 플라스미드 구조를 표현하는 박테리아의 야간 문화와 50 μg / carbenicillin과 chloramphenicol의 ML을 포함. OD 600 nm의에서 0.6 A를 도달하면, 37에서 0.4 M IPTG의 추가와 함께 유도하고 떨고 추가 4 시간 동안 문화를 품어 ° C.
- resuspension 버퍼 산도에서 수확한 세포를 Resuspend = 8.0 (50 MM 트리스 - HCL, 25 % (W / V) 자당, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 MM DTT). 참고 : 알약이 단계에서 냉동 수 있습니다.
- 폴리 프로필렌의 비커에 세균성 resuspensions의 더 이상 60 이상 ML을 풀. 필요는 TE 버퍼 산도 8.0 60 ML에 적응 절반 속도로 혼합물을 저어하는 경우.
- 혼합물을 교반하려면 드롭 현명한 추가 라이 소 자임 (최종 = 1 MG / ML), MgCl2 (최종 = 5 ㎜), 2 MG DNAse 나는 50 % 글리세롤 75 MM NaCl, 트리톤 - X100 (최종 = 1 %), DTT를 (들어 최종 = 10 ㎜).
- 1.5 분 얼음 솔루션을 Sonicate 4에서 10 분, 5,000 RPM에서 lysates을 원심 ° C.
- 뜨는을 가만히 따르다.
- 세척 버퍼 산도 15 ML 추가 = 8.0 (50 MM 트리스 - HCL, 0.5 % 트리톤 X - 100, 100 MM NaCl, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 MM DTT).
- 펠렛가 완전히 resuspended 때까지 얼음, 1.5 분 솔루션을 sonicate.
- 4 10 분 5,000 RPM에서 샘플을 원심 ° C.
- 세탁 5 회 반복합니다.
- TE 버퍼 4 ML에서 트리톤 X - 100, 원심 분리기 및 resuspend없이 세척 버퍼와 5B를 반복합니다.
- 30-100 MG / ML의 농도에 젖은 무게 포함 기관의 슬러리 및 TE 버퍼에 저장을 가져가라.
KLRG1의 Refolding
- 버퍼 산도를 refolding 1 L 만들기 = 8.0 (0.4 M 아르기닌 - HCL, 0.1 M 트리스 산도 8-8.3, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.2 MM PMSF, 3 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료 테아제 억제제의 알약, 5 MM의 GSH와 0.5 MM의 GSSG)과 오한 4 ° C 감동하면서.
- 접는 혼합물에 주입에 대한 포함 시체를 준비 : 이것은 단백질의 최종 농도가 2 3 μm의 될 수 있도록 0.25 0.5 μm의 농도로 각 5 10 주사를 만들기 위해 이상적입니다.
- 10 MM β - 메르 캅 토 에탄올과 7 M GnHCl에 포함 기관 슬러리의 50 MG의 볼륨을 용융.
- 유지 37 포함 기관 / GnHCl 혼합 ° 30 C - 40 분 및 와동 매 5 분 (슬러리가 완전히 녹아되면 취소가됩니다) 전체 융해를 보장합니다.
- 4 microcentrifuge 30 분 최대 속도로 원심 분리기 ° C와 15 ML의 원심 관에 뜨는을 전송하기만하면됩니다. 작은 거무스름한 펠릿 중 하나를 전송하지 마십시오.
- 사출 버퍼 (3 M GnHCl, 10 MM의 NaAcetate, 산도 4.2,10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))로 볼륨을 조정하십시오.
- 희석 포함 단체 1 ML 매 시간마다 주사. 주입하면, 높은 속도로 저어 각 드롭 사이 이초와 드롭하여 희석 포함 단체 드롭 1 ML를 추가합니다. 주입이 완료되면 낮은 속도로 저어.
- 4 낮은 속도로 감동 밤새 계속 ° C.
Refolding 반응 농도
- Millipore의 프로토콜에 따라, Amicon를 사용하여 사전에 필터링 (0.22 μm의이 여과) refolding 반응의 제 1 L를 집중 셀 및 ~ 10 ML에 YM10 NMWL 10K의 ultrafiltration 막 (Millipore)를 만들어 냈다.
- 사용 Centriplus YM - 10 10K MWCO (Millipore).을 ≤ 2 ML에 집중
KLRG1 tetramer의 정화
- 4 AKTAFPLC를 설정 ° C GE 헬스케어 설명서에 따라.
- Sephacryl S - 200 60분의 16 고해상도 20 MM의 HEPES에서 열 (GE 헬스케어) 150 MM NaCl을 사용하여 크기를 제외 크로마 토그래피에 의해 KLRG1의 모노머 양식을 정화. (그림 1 참조).
- Centriplus를 사용하여 한 ML에 집중 YM - 10 10K MWCO (Millipore).
- KLRG1 단량체를 biotinylate하는 욕망의 프로토콜에 따라 비라 효소를 사용합니다.
- 무료 비오틴은 2와 같은 크기 배제 크로마 토그래피에 의해 제거됩니다.
- KLRG1 분자는 4 배 초과 어금니 PE 복합 streptavidin (BD Biosciences)와 KLRG1 단량체를 혼합하여 tetramerized 있습니다.
대표 결과
의 악타 FPLC 크기 배제 크로마 토그래피에서 그림 1. 대표 긍정적인 결과 KLRG1를 refolded. 그래프는 단량체의 분리 (83.52 ML), 이합체 (56.36 ML) 및 refolded KLRG1의 multimer (36.26 ML) 양식을 보여줍니다. 94.25 ML에있는 정상은 버퍼 교환을 나타냅니다.
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Discussion
이 프로토콜에서는, 그것은 biotinylate, 정화하는 방법을 표시하고, tetramerize KLRG1입니다. KLRG1 tetramer는 유동세포계측법로 KLRG1 리간드 레이블을 사용할 수 있습니다. refolding 조건이 각각의 단백질에 대해 경험적으로 테스트해야되지만, 다른 C - 타입 lectins은 유사한 프로토콜을 사용 tetramerized 수 있습니다. 프로브, 고아 C - 타입 렉틴 수용체에 리간드로 tetramerized 단백질을 사용하면 잠재적으로 식별 수 있습니다.
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Acknowledgments
우리는 refolding 조건을 최적화에 대한 도움 박사 Naidenko 감사합니다. 이 작품은 로랑 Brossay에 NIH 연구 부여 AI58181에 의해 지원되었다. 신디 반은 NIH NRSA F31 AI080230에 의해 지원됩니다.
스테파니 Terrizzi와 신디 반이 작품에 동등하게 기여하고 있습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche Group | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | EMD Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | EMD Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | EMD Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
- Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
- Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition. Immunity. 31, 35-46 (2009).
- Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.
