Summary
このプロトコルは、KLRG1リガンドの分析のための強力なツールですKLRG1四量体、の製造を説明します。
Abstract
キラー細胞レクチン様受容体のG1（KLRG1）はC型レクチン様スーパーファミリーに属するII型膜貫通糖タンパク質抑制性受容体である。 KLRG1は、モノマーとして、及びジスルフィド結合ホモダイマーとしても存在する。このよく保存された受容体は、最も成熟し、最近では活性化NK細胞だけでなく、エフェクター/メモリーT細胞のサブセットに記載されています。
KLRG1四量体だけでなく、他の方法を使用して、E -、N -、およびR -カドヘリンはKLRG1リガンドとして同定された。これらのCa 2 +依存性細胞間接着分子は細胞間相互作用、膜貫通ドメインとアクチン細胞骨格にリンクされている細胞質ドメインの責任fiveカドヘリンリピートを含む細胞外ドメインで構成する。
KLRG1四量体の生成はKLRG1リガンドの同定に不可欠でした。 KLRG1四量体はまた、免疫応答と組織の整合性の調節に役割のカドヘリンとKLRG1プレイを解明するユニークなツールです。
Protocol
封入体の調製
- TBの4 × 500ミリリットルのフラスコに接種する各KLRG1プラスミド構築物を発現している細菌の一晩培養では50μg/カルベニシリンとのクロラムフェニコールを含む。 ODが600 nmで0.6 Åに達すると、37℃で0.4 M IPTGの添加により誘導と握手さらに4時間培養液を、C.
- 再懸濁緩衝液pH = 8.0（50mMトリス- HCl、25％（W / V）ショ糖、1mMのEDTA、10mMのDTT）で採取された細胞を再懸濁します。注：ペレットがこの段階で凍結することができます。
- ポリプロピレンのビーカー内の細菌resuspensionsを60mlよりプールこれ以上ない。必要な場合は、TE緩衝液pH8.0で60 mlに調整し、半分の速度で混合物をかき混ぜる。
- 攪拌混合物に滴下して加える：リゾチーム（最終= 1 mg / ml）を、MgCl2の（最後の= 5 mM）を、2 mgをDNase Iでは50％グリセロール、75 mM NaClを、トリトン- X100を（最後の= 1％）含まれて、DTTを（最後の= 10 mM）を。
- 1.5分間氷上でソリューションを超音波処理し、4℃で10分間、5,000 rpmでライセートを遠心℃に
- 上清をデカント。
- 洗浄緩衝液の15 mlを加え= 8.0（50mMトリス- HCl、0.5％トリトンX - 100、100mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのDTT）。
- ペレットが完全に再懸濁されるまで氷上で、1.5分間のソリューションを超音波処理。
- で10分間4℃でサンプルを5,000 rpmで遠心する
- 洗濯5回を繰り返します。
- TEバッファー4mlのトリトンX - 100、遠心分離と再懸なく、洗浄バッファーで5bを繰り返します。
- 30から100 mg / mlの濃度で湿重量の封入体のスラリーとTEバッファーに格納してください。
KLRG1のリフォールディング
- バッファーのpHをリフォールディングの1 Lを作る= 8.0（0.4 Mアルギニン塩酸、0.1 MトリスpHは8〜8.3、2mMのEDTA、0.2mMのPMSF、3 EDTA -フリープロテアーゼ阻害剤の錠剤、5mMのGSHおよび0.5mM GSSG）とチル〜4℃、攪拌しながら。
- 折り畳み式の混合物への注入のために封入体を準備する：これは、タンパク質の最終濃度が2 3μMとなるように0.25 0.5μMの濃度で各5 10注射をするのに最適です。
- 10mMのβ-メルカプトエタノールで7 M GnHClにおける封入体のスラリーの50mgの量を溶かす。
- 37℃で封入体/ GnHCl混合物を保持℃で30用のC - 40分と渦完全な溶融を確実にするために5分ごとに（完全に溶融するときにスラリーが明らかになる）。
- 4で微量遠心機で30分間最大速度で遠心° Cと15 ml遠心チューブに上清を移す。小さな黒っぽいペレットのいずれかを転送するためにしないでください。
- インジェクションバッファー（3 M GnHCl、10mMの酢酸ナトリウム、pHは4.2,10 mMのEDTA）で音量を調整します。
- 希薄化後の封入体時間ごとの1mlを注入する。注入するときは、各ドロップの間に2秒でドロップによる希薄化後の封入体の降下の1 mlを追加する、高速でかき混ぜる。注入が完了すると、低速でかき混ぜる。
- 一晩4℃で低速で撹拌し続ける℃に
リフォールディング反応の濃度
- ミリポアのプロトコールに従い、アミコンを使用して（0.22μmのフィルタ処理）フィルタの適用前のリフォールディング反応の1 Lを集中〜10 mlに細胞とYM10 NMWL 10K限外ろ過膜（Millipore）を攪拌。
- Centriplus YM - 10 10K MWCOを（ミリポア）を使用して≤2 mlに集中する。
KLRG1四量体の精製
- 4時AKTAFPLCをセットアップ° C GEヘルスケアのマニュアルにしたがって。
- 20mMのHEPES、150 mMのNaClでセファクリルS - 200 60分の16の高分解能カラム（GE Healthcare）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによってKLRG1の単量体の形を浄化する。 （図1を参照してください）。
- Centriplus YM - 10 10K MWCOを（ミリポア）を使用して1mlに濃縮する。
- KLRG1モノマーをビオチニル化するために親和力のプロトコルに従ってのBirA酵素を使用してください。
- 遊離ビオチンは、2のようにサイズ排除クロマトグラフィーによって除去される。
- KLRG1分子を4倍モル過剰PE結合ストレプトアビジン（BD Biosciences社）でKLRG1モノマーを混合することによりtetramerizedている。
代表的な結果
図1代表的なリフォールディングKLRG1のAKTA FPLCのサイズ排除クロマトグラフィーからの肯定的な結果を。グラフは、モノマーの分離（83.52ミリリットル）、ダイマー（56.36ミリリットル）、およびリフォールディングKLRG1のマルチマー（36.26ミリリットル）の形式を示しています。 94.25ミリリットルのピークは、バッファの交換を表します。
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Discussion
このプロトコルでは、ビオチニル化する、精製する方法が示され、tetramerize KLRG1ている。 KLRG1四量体はフローサイトメトリーでKLRG1リガンドを標識するために使用することができます。リフォールディング条件は各タンパク質のために経験的にテストされる必要があるものの、他のC型レクチンは、同様のプロトコルを使用してtetramerizedすることができます。プローブとしてtetramerizedタンパク質を使用して、孤児のC型レクチン受容体にリガンドが潜在的に同定することができた。
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Acknowledgments
我々は、リフォールディング条件を最適化することで助けを博士Naidenkoに感謝。この作品は、ローランBrossayにNIHの研究助成金AI58181によってサポートされていました。シンディあるbanhはNIH NRSA F31 AI080230によってサポートされています。
ステファニーTerrizziとシンディあるbanhはこの作品にも同様に寄与する。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche Group | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | EMD Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | EMD Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | EMD Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
- Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
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- Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.
