Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Produktion von KLRG1 Tetramer, die ein leistungsfähiges Werkzeug für die Analyse von KLRG1 Liganden ist.
Abstract
Killer-Zelle Lektin-like-Rezeptor G1 (KLRG1) ist ein Typ II Transmembran-Glykoprotein inhibitorischen Rezeptor gehört zu den C-Typ Lektin-ähnliche Superfamilie. KLRG1 existiert sowohl als Monomer und als Disulfid-linked-Homodimer. Dieses gut erhaltene Rezeptor befindet sich auf der reifsten und zuletzt aktivierte NK-Zellen als auch auf eine Teilmenge von Effektor / Memory T-Zellen gefunden.
Mit KLRG1 Tetramer sowie andere Methoden, E-, N-und R-Cadherine wurden als KLRG1 Liganden identifiziert. Diese Ca 2 +-abhängige Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle besteht aus einer extrazellulären Domäne mit fünf Cadherin wiederholt für Zell-Zell-Interaktionen, eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne, die an das Aktin-Zytoskelett verknüpft ist.
Die Erzeugung der KLRG1 Tetramer war notwendig, um die Identifikation der KLRG1 Liganden. KLRG1 Tetramer ist auch ein einzigartiges Werkzeug, um die Rollen Cadherin und KLRG1 spielen bei der Regulation der Immunantwort und Gewebe Integrität aufzuklären.
Protocol
Vorbereitung von Inclusion Bodies
- Impfen 4 x 500 ml Flaschen TB mit je 50 pg / ml Carbenicillin und Chloramphenicol mit einer Übernachtkultur von Bakterien Ausdruck der KLRG1 Plasmid-Konstrukt. Wenn die OD 0.6 Å erreicht bei 600 nm, mit der Zugabe von 0,4 M IPTG induziert und inkubieren Sie die Kultur für weitere 4 Stunden unter Schütteln bei 37 ° C.
- Resuspendieren die geernteten Zellen in Resuspensionspuffer pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 25% (W / V) Saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Hinweis: Pellets können in diesem Stadium eingefroren werden.
- Pool nicht mehr als 60 ml der bakteriellen resuspensions in einem Polypropylen-Becher. Wenn nötig, 60 ml einstellen mit TE-Puffer pH 8,0 und rühren Mischung mit halber Geschwindigkeit.
- Um Rühren zuzusetzen tropfenweise: Lysozym (final = 1 mg / ml), MgCl2 (final = 5 mm), 2 mg DNAse I in 50% Glycerin enthielt 75 mM NaCl, Triton-X100 (final = 1%), DTT ( Finale = 10 mm).
- Mit Ultraschall die Lösung auf Eis für 1,5 min und Zentrifuge die Lysate bei 5.000 RPM für 10 min bei 4 ° C.
- Den Überstand.
- 15 ml Waschpuffer pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 0,5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
- Auf Eis, beschallen Lösung für 1,5 min, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 5.000 RPM für 10 min bei 4 ° C.
- Wiederholen Sie die Wäsche 5 mal.
- Wiederholen Sie die 5b mit Waschpuffer ohne Triton X-100, Zentrifuge und resuspendieren in 4 ml TE-Puffer.
- Nehmen Sie das Nassgewicht inclusion bodies Gülle und speichern in TE-Puffer bei einer Konzentration von 30 bis 100 mg / ml.
Rückfaltung von KLRG1
- Machen Sie 1 L der Rückfaltung pH = 8,0 (0,4 M Arginin-HCl, 0,1 M Tris pH 8 bis 8,3, 2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 3 EDTA-freie Protease-Inhibitor Tabletten, 5 mM GSH und 0,5 mM GSSG) und Chill bis 4 ° C unter Rühren.
- Bereiten Sie die inclusion bodies für die Injektion in die Faltung Mischung: Es ist ideal, um 5 10 Injektionen zu machen mit jeweils 0,25 0,5 uM Konzentration, so dass die Endkonzentration des Proteins wird 2 3 uM werden.
- Melt das Volumen von 50 mg inclusion bodies Gülle in 7 M GnHCl mit 10 mM β-Mercaptoethanol.
- Halten Sie die inclusion bodies / GnHCl Mischung bei 37 ° C für 30 bis 40 min und Vortex alle 5 min ein vollständiges Aufschmelzen gewährleisten (Gülle wird deutlich werden, wenn sie vollständig geschmolzen).
- Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit für 30 min in Mikrozentrifuge bei 4 ° C und den Überstand in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Leisten Sie keine der kleinen schwärzlichen Pellet zu übertragen.
- Anpassen der Lautstärke mit Injektionspuffer (3 M GnHCl, 10 mM NaAcetate, pH 4.2,10 mM EDTA).
- Inject 1 ml der verdünnten inclusion bodies jede Stunde. Bei der Injektion, mit hoher Geschwindigkeit rühren, 1 ml der verdünnten inclusion bodies tropfenweise mit 2 Sekunden zwischen den einzelnen Tropfen. Wenn Injektion durchgeführt wird, bei niedriger Geschwindigkeit rühren.
- Weiter über Nacht unter Rühren bei niedriger Geschwindigkeit bei 4 ° C.
Die Konzentration der Rückfaltung Reaktionen
- Nach Millipore s Protokoll, konzentrieren sich die 1 L von pre-filtriert (0,22 um filtriert) Rückfaltung Reaktion unter Verwendung einer Amicon Rührzelle und YM10 NMWL 10K Ultrafiltrationsmembran (Millipore) auf ~ 10 ml.
- Konzentrieren Sie sich auf ≤ 2 ml mit einem Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
Reinigung von KLRG1 Tetramer
- Richten Sie die AKTAFPLC bei 4 ° C nach GE Healthcare Handbücher.
- Purify das Monomer Form KLRG1 durch Größenausschlusschromatographie über eine Sephacryl S-200 16/60 hochauflösende Säule (GE Healthcare) in 20 mM HEPES und 150 mM NaCl. (Siehe Abbildung 1).
- Konzentrieren Sie sich auf 1 ml mit Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
- Verwenden Sie BirA Enzym gemäß Avidity s Protokoll zum KLRG1 Monomer biotinylieren.
- Das freie Biotin wird durch Größenausschlusschromatographie wie in 2 eliminiert.
- KLRG1 Molekül wird durch Mischen KLRG1 Monomer mit 4-fachen molaren Überschuss PE-konjugiertes Streptavidin (BD Biosciences) tetramerisieren.
Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Representative positive Ergebnisse aus der AKTA FPLC Größenausschlusschromatographie der refolded KLRG1. Die Grafik zeigt die Trennung der Monomer (83,52 ml), Dimer (56,36 ml) und Multimer (36,26 ml) Form des refolded KLRG1. Der Peak bei 94,25 ml stellt der Puffer auszutauschen.
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Discussion
In diesem Protokoll wird gezeigt, wie man zu reinigen, und Biotinylierung tetramerize KLRG1. KLRG1 Tetramer kann verwendet werden, um KLRG1 Liganden mittels Durchflusszytometrie Label sein. Obwohl Rückfaltungsbedingungen müssen empirisch für jedes Protein getestet werden, könnten auch andere C-Typ-Lektine tetramerisieren mit einem ähnlichen Protokoll. Mit tetramerisieren Proteine als Sonden, Liganden zu Orphan C-Typ Lektin-Rezeptoren möglicherweise identifiziert werden.
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Acknowledgments
Wir danken Dr. Naidenko um Hilfe bei der Optimierung der Rückfaltung Bedingungen. Diese Arbeit wurde vom NIH Forschungsstipendium AI58181 zu Laurent Brossay unterstützt. Cindy Banh wird durch NIH NRSA F31 AI080230 unterstützt.
Stephanie Terrizzi und Cindy Banh beitragen gleichermaßen zu dieser Arbeit.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche Group | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | EMD Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | EMD Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | EMD Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
- Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
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- Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.
