Summary
Detta protokoll beskriver produktionen av KLRG1 tetramer, som är ett kraftfullt verktyg för analys av KLRG1 ligander.
Abstract
Killer cell lektin-like receptor G1 (KLRG1) är en typ II transmembrant glykoprotein hämmande receptor som tillhör C-typ lektin-liknande superfamiljen. KLRG1 finns både som monomer och som disulfide-linked homodimer. Denna väl bevarade receptorn finns på de mest mogna och nyligen aktiverade NK-celler samt på en delmängd av effektor / minne T-celler.
Använda KLRG1 tetramer såväl som andra metoder, E-, N-och R-cadherins identifierades som KLRG1 ligander. Dessa Ca2 +-beroende cell-cell adhesionsmolekyler består av en extracellulär domän som innehåller fem cadherin upprepar ansvarig för cell-cell interaktioner, en transmembranös domän och ett cytoplasma domän som är kopplad till aktin cytoskelettet.
Generationen av KLRG1 tetramer var viktigt att identifieringen av KLRG1 ligander. KLRG1 tetramer är också ett unikt verktyg för att belysa de roller cadherin och KLRG1 spela i regleringen av immunförsvaret och vävnaden integritet.
Protocol
Beredning av inklusionskroppar
- Inokulera 4 x 500 ml kolvar av TB var och en innehåller 50 mikrogram / ml Carbenicillin och kloramfenikol med en övernattning kultur av bakterier uttrycka KLRG1 plasmiden konstruera. När OD når 0,6 A vid 600 nm, framkalla med tillägg av 0,4 M IPTG och inkubera kulturen i ytterligare 4 timmar skaka vid 37 ° C.
- Resuspendera skördas cellerna i resuspension pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 25% (w / v) sackaros, 1 mM EDTA, 10 mm DTT). Obs: pellets kan frysas i detta skede.
- Pool inte mer än 60 ml av bakteriella resuspensions i polypropylen bägare. Om nödvändigt justera till 60 ml med TE-buffert pH 8,0 och rör blandningen på halvfart.
- För att röra om blandningen lägga droppvis: lysozym (slutlig = 1 mg / ml), MgCl2 (slutlig = 5 mm), 2 mg DNAse jag i 50% glycerol innehöll 75 mM NaCl, Triton-X100 (slutlig = 1%), DTT ( sista = 10 mm).
- Sonikera lösningen på is 1,5 minuter och centrifugera lysates på 5000 RPM i 10 min vid 4 ° C.
- Häll av supernatanten.
- Tillsätt 15 ml tvättbuffert pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 0,5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mm DTT).
- På is, Sonikera lösning för 1,5 min tills pelleten är helt återsuspenderade.
- Centrifugera proverna vid 5000 RPM i 10 min vid 4 ° C.
- Upprepa tvätta 5 gånger.
- Upprepa 5b med tvättbuffert utan Triton X-100, centrifug och återsuspendera i 4 ml TE buffert.
- Ta våtvikt inklusionskroppar slam och förvara i TE buffert vid en koncentration på 30 till 100 mg / ml.
Vika av KLRG1
- Gör ett L i vika pH = 8,0 (0,4 M arginin-HCl, 0,1 M Tris pH 8-8,3, 2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 3 EDTA-fritt proteashämmare tabletter, 5 mm GSH och 0,5 mm GSSG) och kyla till 4 ° C under omrörning.
- Förbered inklusionskroppar för injektion i fällbara blandningen: Det är perfekt att göra 5 10 injektioner med vardera 0,25 0,5 mikroM koncentration så att den slutliga koncentrationen av proteinet kommer att bli 2 3 mikroM.
- Smält volym på 50 mg inklusionskroppar slam i 7 M GnHCl med 10 mM β-merkaptoetanol.
- Håll inklusionskroppar / GnHCl blandningen vid 37 ° C i 30 - 40 min och virveln var 5 min för att säkerställa fullständig smältning (gödsel blir tydligt när helt smält).
- Centrifugera vid max hastighet i 30 min i mikrocentrifug vid 4 ° C och överför supernatanten till ett 15 ml centrifugrör. Har inte överföra några av de små svartaktiga pelleten.
- Justera volymen med injektion buffert (3 M GnHCl, 10 mm NaAcetate, pH 4.2,10 mM EDTA).
- Injicera 1 ml utspädd inklusionskroppar varje timme. Vid injektion, rör i hög hastighet, tillsätt 1 ml utspädd inklusionskroppar droppe för droppe med 2 sekunder mellan varje droppe. När injektionen är klar, rör vid låg hastighet.
- Fortsätt natten omrörning i låg fart vid 4 ° C.
Koncentration av vika reaktioner
- Efter Millipore s protokoll, koncentrera 1 L i förfiltrerade (0,22 ìm filtrerad) vika reaktion med hjälp av en Amicon Stirred Cell och YM10 NMWL 10K ultrafiltrering membran (Millipore) till ~ 10 ml.
- Koncentrera till ≤ 2 ml med hjälp av en Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
Rening av KLRG1 tetramer
- Ställ in AKTAFPLC vid 4 ° C enligt GE Healthcare manualer.
- Rena monomer form av KLRG1 efter storlek utanförskap kromatografi med en Sephacryl S-200 16/60 högupplösta kolumn (GE Healthcare) i 20 mM HEPES och 150 mM NaCl. (Se figur 1).
- Koncentrera till 1 ml med hjälp Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
- Använd Bira enzym enligt aviditet s protokoll till biotinylate de KLRG1 monomer.
- Den fria biotin elimineras genom storlek utanförskap kromatografi som i 2.
- KLRG1 molekyl tetramerized genom att blanda KLRG1 monomer med 4 gånger molar än PE-konjugerat streptavidin (BD Biosciences).
Representativa resultat
Figur 1. Representant positiva resultat från AKTA FPLC storlek uteslutning kromatografi på refolded KLRG1. Diagrammet visar separation av monomer (83,52 ml), dimer (56,36 ml) och multimer (36,26 ml) form refolded KLRG1. Toppen vid 94,25 ml representerar buffert utbyte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll, visas det hur man kan rena, biotinylate och tetramerize KLRG1. KLRG1 tetramer kan användas för att märka KLRG1 ligander med flödescytometri. Trots att vika villkor kommer att testas empiriskt för varje protein kan andra C-typ lektiner vara tetramerized med ett liknande protokoll. Använda tetramerized proteiner som prober, ligander till föräldralösa C-typ lektin receptorer skulle kunna identifieras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Naidenko om hjälp med att optimera vika förhållanden. Detta arbete stöddes av NIH forskningsanslag AI58181 till Laurent Brossay. Cindy Banh stöds av NIH NRSA F31 AI080230.
Stephanie Terrizzi och Cindy Banh bidra lika mycket till detta arbete.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche Group | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | EMD Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | EMD Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | EMD Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
- Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
- Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition. Immunity. 31, 35-46 (2009).
- Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.
