Summary
इस प्रोटोकॉल KLRG1 tetramer, जो KLRG1 ligands के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है के उत्पादन का वर्णन.
Abstract
खूनी सेल रिसेप्टर लेक्टिन की तरह G1 (KLRG1) एक प्रकार द्वितीय transmembrane ग्लाइकोप्रोटीन निरोधात्मक सी प्रकार लेक्टिन की तरह superfamily संबंधित रिसेप्टर है. KLRG1 दोनों एक monomer के रूप में और डाइसल्फ़ाइड से जुड़े homodimer के रूप में मौजूद है. यह अच्छी तरह से संरक्षित रिसेप्टर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से effector / स्मृति टी कोशिकाओं के एक सबसेट पर सबसे परिपक्व और हाल ही में सक्रिय एन.के. कोशिकाओं पर पाया जाता है.
KLRG1 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से tetramer अन्य तरीकों का उपयोग, ई, एन, और आर cadherins KLRG1 ligands के रूप में पहचान की गई. ये 2 Ca + निर्भर सेल कोशिका आसंजन अणुओं एक कोशिकी पाँच cadherin सेल सेल बातचीत, एक transmembrane डोमेन और एक cytoplasmic डोमेन है कि actin cytoskeleton से जुड़ा हुआ है के लिए जिम्मेदार दोहराता युक्त डोमेन शामिल हैं.
KLRG1 tetramer की पीढ़ी KLRG1 ligands की पहचान के लिए आवश्यक था. KLRG1 tetramer भी एक अद्वितीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और ऊतक की अखंडता को विनियमित करने में भूमिकाओं cadherin और KLRG1 खेलने को स्पष्ट उपकरण है.
Protocol
समावेशन निकायों की तैयारी
- X 4 टीबी के 500 मिलीलीटर बोतल टीका लगाना प्रत्येक KLRG1 प्लाज्मिड का निर्माण व्यक्त जीवाणुओं की एक रात में संस्कृति के साथ 50 μg / carbenicillin और chloramphenicol के मिलीलीटर युक्त. जब आयुध डिपो 600 एनएम पर 0.6 Å तक पहुँचता है, 0.4 एम IPTG के अलावा के साथ प्रेरित और 37 पर एक अतिरिक्त 4 मिलाते घंटे के लिए संस्कृति सेते डिग्री सेल्सियस
- Resuspension बफर पीएच में काटा कोशिकाओं Resuspend = 8.0 (50 Tris - एचसीएल मिमी, 25% (डब्ल्यू / वी) sucrose, 1 मिमी EDTA, 10 मिमी डीटीटी). नोट: छर्रों इस स्तर पर जमे हुए किया जा सकता है है.
- एक polypropylene बीकर में बैक्टीरियल resuspensions कोई 60 से अधिक मिलीलीटर पूल. यदि ते बफर पीएच 8.0 के साथ 60 मिलीलीटर के लिए आवश्यक समायोजित और आधा गति पर मिश्रण हलचल.
- मिश्रण सरगर्मी के ड्रॉप बुद्धिमान जोड़ें: lysozyme (अंतिम = 1 मिलीग्राम / एमएल), MgCl2 (अंतिम = 5 मिमी), 2 मिलीग्राम DNase मैं 50% ग्लिसरॉल में 75 मिमी NaCl, ट्राइटन-X100 (अंतिम = 1%), डीटीटी निहित ( अंतिम मिमी = 10).
- 1.5 मिनट के लिए बर्फ पर समाधान Sonicate और 5,000 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए 4 lysates अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- सतह पर तैरनेवाला छानना.
- धोने बफर पीएच के 15 मिलीलीटर जोड़ें = 8.0 (50 Tris - एचसीएल मिमी, 0.5% Triton एक्स 100, 100 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 1 मिमी डीटीटी).
- बर्फ पर, 1.5 मिनट के लिए समाधान sonicate जब तक पूरी तरह से गोली resuspended है.
- 4 में 10 मिनट के लिए 5,000 आरपीएम पर नमूने अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- धोने 5 बार दोहराएँ.
- ट्राइटन X-100, और ते बफर के 4 मिलीलीटर में अपकेंद्रित्र resuspend बिना धोने बफर के साथ 5b दोहराएँ.
- गीला वजन शामिल किए जाने के निकायों और 30 से 100 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में ते बफर में स्टोर घोल लें.
KLRG1 के refolding
- बफर पीएच refolding के 1 एल = 8.0 (0.4 Arginine एचसीएल एम एम 0.1 Tris 8-8.3 पीएच, 2 मिमी EDTA, 0.2 मिमी PMSF, 3 EDTA मुक्त protease अवरोध करनेवाला गोलियाँ, 5 मिमी GSH और 0.5 मिमी GSSG) और सर्द 4 करने के लिए डिग्री सेल्सियस जबकि क्रियाशीलता.
- तह मिश्रण में इंजेक्शन के लिए शामिल किए जाने शरीर को तैयार: यह आदर्श है 5 10 इंजेक्शन प्रत्येक 0.25 0.5 सुक्ष्ममापी एकाग्रता के साथ इतना है कि प्रोटीन की अंतिम एकाग्रता 2 3 सुक्ष्ममापी जाएगा.
- 7 एम GnHCl में शामिल किए जाने निकायों घोल के 50 मिलीग्राम की मात्रा 10 मिमी β-mercaptoethanol के साथ पिगलो.
- रखें शरीर 37 / GnHCl मिश्रण शामिल किए जाने ° 30 के लिए सी - 40 मिनट और भंवर हर 5 पूरा पिघलने सुनिश्चित (घोल स्पष्ट हो जब पूरी तरह से पिघल जाएगा) मिनट.
- Microcentrifuge में 30 मिनट के लिए अधिकतम गति से 4 बजे अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस और एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण. छोटे काले रंग की गोली के किसी भी हस्तांतरण नहीं करो.
- इंजेक्शन बफर (3 एम GnHCl, 10 मिमी NaAcetate, पीएच 4.2,10 मिमी EDTA) के साथ मात्रा समायोजित करें.
- पतला शामिल किए जाने निकायों के 1 मिलीलीटर हर घंटे इंजेक्षन. जब इंजेक्शन, उच्च गति पर हलचल, एक बूंद के बीच 2 सेकंड के साथ छोड़ द्वारा पतला शामिल किए जाने निकायों ड्रॉप के 1 मिलीलीटर जोड़ने. जब इंजेक्शन किया जाता है, कम गति पर हलचल.
- रात भर जारी रखें 4 में कम गति पर सरगर्मी सी. °
Refolding प्रतिक्रियाओं की एकाग्रता
- एस Millipore प्रोटोकॉल के बाद, पूर्व फ़िल्टर (0.22 सुक्ष्ममापी फ़िल्टर) एक Amicon का उपयोग कर refolding प्रतिक्रिया का 1 एल ध्यान सेल और YM10 NMWL 10K ultrafiltration ~~ 10 मिलीलीटर झिल्ली (Millipore) में हड़कंप मच गया.
- Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore) का उपयोग ≤ 2 मिलीलीटर ध्यान लगाओ
KLRG1 tetramer के शोधन
- 4 बजे AKTAFPLC डिग्री सेल्सियस अनुसार जीई हेल्थकेयर मैनुअल सेटअप.
- आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी का उपयोग S-200 16/60 उच्च संकल्प (जीई हेल्थकेयर) 20 मिमी HEPES में स्तंभ और 150 मिमी NaCl Sephacryl द्वारा KLRG1 की monomer के फार्म का शुद्ध. (चित्रा 1 देखें).
- 1 Centriplus का उपयोग मिलीलीटर के लिए ध्यान लगाओ YM-10 10K MWCO (Millipore).
- एस उत्सुकता प्रोटोकॉल के अनुसार बीरा एंजाइम का प्रयोग KLRG1 monomer biotinylate.
- मुक्त बायोटिन आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा 2 में के रूप में समाप्त हो रहा है.
- KLRG1 अणु 4 गुना दाढ़ अतिरिक्त पीई संयुग्मित streptavidin (बी बायोसाइंसेज) के साथ KLRG1 monomer मिश्रण द्वारा tetramerized है.
प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 प्रतिनिधि AKTA FPLC आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी से सकारात्मक परिणाम KLRG1 refolded. ग्राफ monomer के जुदाई (83.52 मिलीलीटर), डिमर (56.36 मिलीलीटर), और refolded KLRG1 के multimer प्रपत्र (36.26 मिलीलीटर) से पता चलता है. 94.25 मिलीलीटर में चोटी बफर मुद्रा का प्रतिनिधित्व करता है.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में, यह दिखाया गया है कैसे शुद्ध करने के लिए, biotinylate, और tetramerize KLRG1. KLRG1 tetramer प्रवाह cytometry द्वारा KLRG1 ligands लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि refolding शर्तों empirically प्रत्येक प्रोटीन के लिए परीक्षण किया जाएगा, अन्य सी - प्रकार lectins एक समान प्रोटोकॉल का उपयोग tetramerized किया जा सकता है. जांच, अनाथ सी प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर्स ligands के रूप में tetramerized प्रोटीन का उपयोग संभावित पहचाना जा सकता है.
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Acknowledgments
हम refolding शर्तों के अनुकूलन में मदद के लिए डॉ. Naidenko धन्यवाद. यह काम लौरेंत Brossay NIH अनुसंधान अनुदान AI58181 द्वारा समर्थित किया गया. सिंडी Banh एनआईएच एनआरएसए F31 AI080230 द्वारा समर्थित है.
स्टेफ़नी Terrizzi और सिंडी Banh इस काम के लिए समान रूप से योगदान करते हैं.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche Group | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | EMD Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | EMD Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | EMD Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
- Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
- Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition. Immunity. 31, 35-46 (2009).
- Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.
