Summary
Este protocolo descreve a produção de KLRG1 tetrâmero, que é uma ferramenta poderosa para a análise de KLRG1 ligantes.
Abstract
Assassino celular G1 receptor lectina-like (KLRG1) é um tipo de receptor da glicoproteína transmembrana II inibitória pertencentes à superfamília tipo C lectina-like. KLRG1 existe tanto como um monômero e como um homodímero dissulfeto ligadas. Este receptor bem conservada é encontrada na maioria das células maduras e recentemente activado NK, bem como em um subconjunto de células T efetoras / memória.
Usando KLRG1 tetrâmero, bem como outros métodos, E, N, e R-caderinas foram identificados como KLRG1 ligantes. Estes Ca 2 + dependentes de célula-célula de moléculas de adesão compreende um domínio extracelular contendo cinco repetições caderina responsável por interações célula-célula, um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático que está ligada ao citoesqueleto de actina.
Geração do tetrâmero KLRG1 foi essencial para a identificação do KLRG1 ligantes. KLRG1 tetrâmero é também uma ferramenta única para elucidar a caderina papéis e jogar KLRG1 na regulação da resposta imune e integridade do tecido.
Protocol
Preparação de Corpos de Inclusão
- Inocular 4 x 500 ml frascos de TB, cada uma contendo 50 mg / ml de cloranfenicol carbenicilina e com uma cultura de bactérias durante a noite expressando a construir KLRG1 plasmídeo. Quando o OD atinge 0,6 Å a 600 nm, induzir com a adição de 0,4 M IPTG e incubar a cultura para um adicional de 4 horas agitação a 37 ° C.
- Ressuspender as células colhidas em pH = 8,0 ressuspensão (50 mM Tris-HCl, 25% (W / V) de sacarose, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Nota: pellets podem ser congeladas nesta fase.
- Piscina não mais que 60 ml de resuspensions bacteriana em um copo de polipropileno. Se necessário, ajustar para 60 ml com tampão TE pH 8,0 e agitar a mistura com metade da velocidade.
- A mistura mexendo add-drop sábio: lisozima (final = 1 mg / ml), MgCl2 (final = 5 mM), 2 mg DNAse I em glicerol a 50% continham 75 mM NaCl, Triton X100 (final = 1%), a TDT ( final = 10 mM).
- Sonicate a solução em gelo por 1,5 min e centrifugar a lisados em 5.000 RPM por 10 min a 4 ° C.
- Decantar o sobrenadante.
- Adicionar 15 ml de lavagem pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 0,5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
- No gelo, sonicate solução para 1,5 min até que a pelota é completamente ressuspenso.
- Centrifugar as amostras a 5.000 RPM por 10 min a 4 ° C.
- Repita a lavagem 5 vezes.
- Repita 5b com tampão de lavagem sem Triton X-100 centrífugas, e ressuspender em 4 ml de tampão TE.
- Pegue o peso úmido inclusão lama corpos e armazenar em tampão TE para uma concentração de 30 a 100 mg / ml.
Redobrando de KLRG1
- Fazer 1 L de refolding pH = 8,0 (0,4 M-arginina HCl, 0,1 M Tris pH 8-8,3, 2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 3 EDTA livre de comprimidos inibidores da protease, 5 GSH mM e 0,5 mM GSSG) frio e a 4 ° C, agitando.
- Preparar os corpos de inclusão para injeção a mistura dobrar: É ideal para fazer 5 10 injeções cada um com 0,25 mM de concentração 0,5, para que a concentração final da proteína será 2 3 mM.
- Derreta o volume de 50 mg de polpa corpos de inclusão em 7 M GnHCl com 10 mM β-mercaptoetanol.
- Mantenha a inclusão corpos / mistura GnHCl a 37 ° C por 30 - 40 min e vórtice cada 5 minutos para garantir a fusão completa (chorume ficará claro quando completamente derretido).
- Centrifugar a velocidade máxima por 30 minutos em microcentrífuga a 4 ° C e transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 15 ml. Não transferir qualquer um dos pelota pequena enegrecida.
- Ajustar o volume com tampão de injeção (3 M GnHCl, 10 NaAcetate mM, pH 4.2,10 mM EDTA).
- Injectar 1 ml de corpos de inclusão diluído a cada hora. Ao injetar, mexa em alta velocidade, adicionar 1 ml de diluída gota a gota, corpos de inclusão com 2 segundos entre cada gota. Quando a injeção é feita, agitar a baixa velocidade.
- Continue mexendo noite para o dia em baixa velocidade, a 4 ° C.
Concentração de reações redobrando
- Seguindo o protocolo Millipore s, concentrar a L 1 de pré-filtrada reação (0,22 mM filtrada) refolding usando um Amicon Stirred Celular e YM10 membrana de ultrafiltração NMWL 10K (Millipore) para ~ 10 ml.
- Concentre-se a ≤ 2 ml usando um Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
Purificação da KLRG1 tetrâmero
- Configurar o AKTAFPLC a 4 ° C de acordo com manuais GE Healthcare.
- Purificar a forma de monômero de KLRG1 por cromatografia de exclusão utilizando um tamanho Sephacryl S-200 de alta resolução 16/60 coluna (GE Healthcare) em 20 mM HEPES e 150 mM NaCl. (Veja Figura 1).
- Concentrado para 1 ml usando Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
- Use enzima Bira acordo com o protocolo de avidez s para biotinylate do monômero KLRG1.
- A biotina livre é eliminado por cromatografia por exclusão de tamanho como em 2.
- KLRG1 molécula é tetramerized misturando KLRG1 monômero com 4 vezes molar excesso PE estreptavidina conjugada (BD Biosciences).
Resultados representante
Figura 1. Representante resultados positivos da cromatografia de exclusão AKTA FPLC tamanho do refolded KLRG1. O gráfico mostra a separação do monômero (83,52 ml), dímero (56,36 ml), e multimer forma (36,26 ml) da KLRG1 redobrada. O pico em 94,25 ml representa a troca de buffer.
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Discussion
Neste protocolo, é mostrado como purificar, biotinylate e KLRG1 tetramerize. KLRG1 tetrâmero pode ser usado para rotular KLRG1 ligantes por citometria de fluxo. Embora as condições refolding terá de ser testado empiricamente para cada proteína, outras lectinas tipo C pode ser tetramerized usando um protocolo similar. Uso de proteínas tetramerized como sondas, ligantes para receptores órfão tipo C lectina poderia ser identificado.
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Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Naidenko para ajudar a otimizar as condições refolding. Este trabalho foi financiado pelo NIH pesquisa conceder AI58181 para Laurent Brossay. Cindy Banh é suportado pelo NIH NRSA F31 AI080230.
Stephanie Terrizzi e Cindy Banh contribuem igualmente para este trabalho.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche Group | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | EMD Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | EMD Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | EMD Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
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