突触小泡池，利用苯乙烯染料的光转化的研究
Summary
调频染料已宝贵的帮助，在突触动力学的理解。外长荧光显微镜下通常遵循在不同的刺激条件下。然而，与电子显微镜相结合的FM染料的光转化允许不同的突触小泡池的可视化，以及其他超微结构组件，在突触boutons。
Abstract
突触囊泡与质膜（胞吐）的融合是一种神经递质的释放和神经元沟通的必要步骤。囊泡，然后从质膜（内吞作用）检索与一般泳池内的神经末梢的囊泡和分组，直到他们接受一个新的外和内吞作用周期（囊泡循环）。这些过程进行了研究，利用各种技术，如电子显微镜，电录音，安培和电容测量。更重要的是，在过去二十年了荧光标记的标记出现，使光学技术囊泡回收动态跟踪。最常用的标记之一是苯乙烯或FM 染料 1;结构，所有的FM染料含有亲水性的头部和亲油性的尾部通过芳香环和一个或多个双键（图1B）连接。一个古典调频染料实验，以标签的小泡池组成，在洗浴过程中的神经刺激的准备（图1Ai）（电动或高 K +）与染料。这种诱导囊泡循环和随后的染料加载到最近内吞囊泡（图1A I – III）。用染料，染料免费洗澡的刺激第二轮装载水泡后会触发通过胞吐FM释放（图1A IV – V），可以通过监测荧光强度降低（脱色）的过程。
虽然调频染料囊泡循环领域作出了巨大贡献，它是不可能的，以确定使用传统的荧光显微镜下精确定位或个别囊泡形态。出于这个原因，我们在这里解释调频染料，还可以通过光转化为使用电子显微镜吞标记，。光转化技术，利用荧光染料的财产，以强烈的光照下产生的活性氧物种。荧光标记的准备工作都淹没在含有二氨基联苯胺（DAB）解决方案和照明。染料分子产生活性物种的氧化，形成一个稳定的，不溶性沉淀物，有一个黑暗的外观，可以很容易地在电子显微镜2,3杰出民建联。正如民建联只在紧邻的荧光分子（如活性氧是短命）的氧化，该技术确保只荧光标记的结构是将含有电子致密沉淀。因此，该技术允许积极回收细胞器的确切位置和形态的研究。
Protocol
Discussion
应考虑几个关键步骤：
- 民建联的潜伏期后，才应彻底清洗和淬火的准备。否则非反应的戊二醛将与民建联，并导致其降水（通常在平面晶体的形式，这是不是电子致密）。这种沉淀大量发生的筹备工作是很少用于电子显微镜使用。
- 照明时间应优化，测试与几个不同的光照时间相同的筹备工作。根据我们的经验，实现最佳的转换（图2B）在5分钟左右的时间窗口（例如，35至照明开始…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | ||
| Epon resin | Plano | R1030 | ||
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma | D5905 | ||
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade | |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | ||
| Axioskop 2 FS plus | Zeiss | |||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus | Dry objective | ||
| 100W Hg Lamp | Zeiss | |||
| Lamp housing with back mirror | Zeiss | 1007-980 | ||
| MRm camera | Zeiss | 0445-554 | Image acquisition | |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | ||
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | ||
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | ||
| EM | Zeiss | |||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
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