Summary

Etudier Piscines vésicules synaptiques utilisant des colorants styryle photoconversion

Published: February 15, 2010
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Summary

Colorants FM ont été d'une aide précieuse dans la compréhension de la dynamique des synapses. FMS sont normalement suivies sous le microscope à fluorescence dans des conditions de stimulation différents. Toutefois, photoconversion de colorants FM combinée avec la microscopie électronique permet la visualisation des différents bassins des vésicules synaptiques, parmi les composants ultrastructure d'autres, en boutons synaptiques.

Abstract

La fusion des vésicules synaptiques avec la membrane plasmique (exocytose) est une étape nécessaire dans la libération de neurotransmetteurs et de la communication neuronale. Les vésicules sont ensuite extraites de la membrane plasmique (endocytose) et regroupés avec la catégorie générale des vésicules au sein de la terminaison nerveuse, jusqu'à ce qu'ils subissent une nouvelle exo-endocytose et du cycle (recyclage des vésicules). Ces processus ont été étudiés en utilisant une variété de techniques comme la microscopie électronique, les enregistrements électrophysiologiques, l'ampérométrie et des mesures de capacitance. Surtout, au cours des deux dernières décennies un certain nombre de marqueurs marqués par fluorescence émergé, permettant de suivre les techniques optiques vésicules dans leur dynamique de recyclage. L'un des marqueurs les plus couramment utilisés est le styryle ou FM colorant 1; structurellement, tous les colorants contiennent FM une tête hydrophile et une queue lipophile reliés par un anneau aromatique et une ou plusieurs doubles liaisons (Fig. 1B). Une expérience de teinture classique FM pour étiqueter un pool de vésicules consiste à baigner la préparation (fig. 1AI) avec le colorant lors de la stimulation du nerf (électriquement ou avec haute K +). Cela induit le recyclage des vésicules et le chargement ultérieur de la teinture dans des vésicules récemment endocytose (figure 1A I-III). Après le chargement des vésicules avec un colorant, un second tour de la stimulation dans un bain de teinture sans se déclencher la libération FM par exocytose (Fig. 1A IV-V), processus qui peut être suivie par une surveillance de la diminution d'intensité de fluorescence (décoloration).

Bien que les colorants FM ont grandement contribué au domaine de recyclage des vésicules, il n'est pas possible de déterminer la localisation exacte ou la morphologie des vésicules individuels en utilisant la microscopie à fluorescence conventionnelle. Pour cette raison, nous expliquons ici comment FM colorants peuvent également être utilisés comme marqueurs de l'endocytose utilisant la microscopie électronique, à travers photoconversion. La technique exploite la propriété photoconversion de colorants fluorescents pour générer des espèces réactives de l'oxygène sous un éclairage intense. Les préparatifs marqués par fluorescence sont immergés dans une solution contenant diaminobenzidine (DAB) et illuminé. Espèces réactives générées par les molécules de colorant oxyder le DAB, qui forme une société stable, précipité insoluble qui a un aspect sombre et peuvent être facilement distingués en microscopie électronique 2,3. Comme DAB n'est oxydé dans le voisinage immédiat de molécules fluorescentes (comme les espèces réactives de l'oxygène sont de courte durée), la technique garantit que les structures ne sont marqués par fluorescence va contenir le précipité denses aux électrons. La technique permet donc l'étude de l'emplacement exact et la morphologie des activement le recyclage des organelles.

Protocol

1) Préparation de Drosophila melanogaster jonction musculaire neuronale (JNM) Préparer la norme drosophile salin (130 mM NaCl, 36 mM de saccharose, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, MgCl2 2 mM, 5 mM Hepes, pH 7,3 4. Disséquer la préparation dans une solution saline (1,1). Les larves de drosophile se languissait dorsale côte dans un plat Sylgard; sur la face dorsale longitudinale est sectionné, et les organes internes sont enlevés. La préparation est ensuit…

Discussion

A quelques critiques devraient être prises en compte:

  • L'incubation DAB doit être effectuée uniquement après un lavage soigneux et trempe des préparatifs. Sinon, le glutaraldéhyde n'ayant pas réagi va interagir avec le DAB et provoquer sa précipitation (généralement sous la forme de cristaux plats, qui ne sont pas denses aux électrons). Les préparatifs où cette précipitation a lieu en abondance sont rarement exploitables pour la microscopie électronique.
  • Reprises éclairage d…

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
FM 1-43   Invitrogen F10317  
Epon resin   Plano R1030  
di-aminobenzidine hydrochloride   Sigma D5905  
50% Glutaraldehyde   AppliChem A3166 EM grade
Sylgard   Dow Corning 104186298  
Axioskop 2 FS plus   Zeiss    
Objective 20x 0.5 NA   Olympus   Dry objective
100W Hg Lamp   Zeiss    
Lamp housing with back mirror   Zeiss 1007-980  
MRm camera   Zeiss 0445-554 Image acquisition
Ex. Filter (HQ 470/40)   AHF F49-671  
Dichroic (495 DCLP)   AHF F33-100  
Em. Filter (HQ 500 LP)   AHF F42-018  
EM   Zeiss    
Proscan CCD HSS   Proscan Electronic Sys.   1024 x 1024

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
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Cite This Article
Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J. Vis. Exp. (36), e1790, doi:10.3791/1790 (2010).

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