Studiare Piscine vescicole sinaptiche con fotoconversione di coloranti Styryl

Summary

Coloranti FM sono stati di enorme aiuto nella comprensione delle dinamiche sinaptiche. FM sono normalmente seguiti sotto il microscopio a fluorescenza in condizioni di stimolazione differenti. Tuttavia, fotoconversione di coloranti FM combinato con il microscopio elettronico permette la visualizzazione di diverse piscine delle vescicole sinaptiche, tra i componenti ultrastruttura altro, in boutons sinaptica.

Abstract

La fusione delle vescicole sinaptiche con la membrana plasmatica (esocitosi) è un passo necessario nel rilascio dei neurotrasmettitori e la comunicazione neuronale. Le vescicole sono poi recuperati dalla membrana plasmatica (endocitosi) e raggruppati con la riserva generale di vescicole all'interno del terminale nervoso, fino a subire un nuovo ciclo eso-ed endocitosi (riciclo delle vescicole). Questi processi sono stati studiati usando una varietà di tecniche come la microscopia elettronica, le registrazioni elettrofisiologiche, amperometria e misure di capacità. È importante sottolineare che nel corso degli ultimi due decenni una serie di marker fluorescente emerse, consentendo tecniche ottiche per monitorare vescicole nelle loro dinamiche di riciclaggio. Uno degli indicatori più comunemente usato è il styryl o FM colorante ^1, strutturalmente, tutti i coloranti FM contengono una testa idrofila e una coda lipofila collegato tramite un anello aromatico e uno o più doppi legami (Fig. 1B). Un esperimento di tintura classica FM per etichettare un pool di vescicole consiste nel fare il bagno nella preparazione (Fig. 1Ai) con il colorante durante la stimolazione del nervo (elettricamente o con elevata K ^+). Questo induce il riciclo delle vescicole e il caricamento successivo del colorante in vescicole di recente endocitato (Fig. 1A _I-III). Dopo aver caricato le vescicole con colorante, un secondo round di stimoli in una tintura senza bagno sarebbe innescare il rilascio FM per esocitosi (Fig. 1A _IV-V), processo che può essere seguita attraverso il monitoraggio della riduzione dell'intensità di fluorescenza (decolorazione).

Sebbene coloranti FM hanno contribuito grandemente al settore del riciclaggio delle vescicole, non è possibile determinare la localizzazione esatta o morfologia delle vescicole individuali utilizzando la microscopia a fluorescenza convenzionale. Per questo motivo, spieghiamo qui come FM coloranti possono essere utilizzati anche come marcatori endocitico usando la microscopia elettronica, attraverso fotoconversione. La tecnica fotoconversione sfrutta la proprietà di coloranti fluorescenti per generare specie reattive dell'ossigeno sotto illuminazione intensa. Preparati fluorescente sono immersi in una soluzione contenente diaminobenzidina (DAB) e illuminato. Specie reattiva, generate dalle molecole di colorante ossidare il DAB, che forma una stalla, precipitato insolubile che ha un aspetto scuro e sono facilmente riconoscibili in microscopia elettronica a ^2,3. Come DAB è solo ossidato nelle immediate vicinanze di molecole fluorescenti (come le specie reattive dell'ossigeno sono di breve durata), la tecnica fa sì che le strutture solo fluorescente stanno per contenere l'elettrone-denso precipitato. La tecnica permette quindi lo studio della posizione esatta e la morfologia del attivamente riciclaggio organelli.

Protocol

1) Preparazione della giunzione Drosophila melanogaster neuronale muscolare (NMJ) Preparare standard di Drosophila salina (130 mM NaCl, 36 mM saccarosio, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 5 Hepes mM, pH 7.3 4. Sezionare la preparazione in soluzione salina (1,1). Le larve di Drosophila si struggeva dorsale laterale in un piatto Sylgard, il lato dorsale è sezionato longitudinale, e gli organi interni vengono rimossi. La preparazione è poi allungato e si st…

Discussion

A pochi passi critici devono essere presi in considerazione:

• L'incubazione DAB deve essere eseguita solo dopo il lavaggio accurato e tempra dei preparativi. Altrimenti la glutaraldeide non ha reagito interagirà con DAB e provocare la sua precipitazione (in genere sotto forma di cristalli piatti, che non sono densi di elettroni). Preparativi in ​​cui questo avviene precipitazioni abbondantemente sono raramente utilizzabili per la microscopia elettronica.
• Tempi di illuminazione deve essere …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
FM 1-43		Invitrogen	F10317
Epon resin		Plano	R1030
di-aminobenzidine hydrochloride		Sigma	D5905
50% Glutaraldehyde		AppliChem	A3166	EM grade
Sylgard		Dow Corning	104186298
Axioskop 2 FS plus		Zeiss
Objective 20x 0.5 NA		Olympus		Dry objective
100W Hg Lamp		Zeiss
Lamp housing with back mirror		Zeiss	1007-980
MRm camera		Zeiss	0445-554	Image acquisition
Ex. Filter (HQ 470/40)		AHF	F49-671
Dichroic (495 DCLP)		AHF	F33-100
Em. Filter (HQ 500 LP)		AHF	F42-018
EM		Zeiss
Proscan CCD HSS		Proscan Electronic Sys.		1024 x 1024