فك رموز محواري مقررات تمهيدية للمجموعات المحددة وراثيا من الخلايا العصبية في الأنبوبة العصبية الاستفادة الفرخ في البيضة Electroporation

Summary

هذا الفيديو يوضح كيفية تصور مسارات محواري مجموعات محددة وراثيا من الخلايا العصبية في النخاع الشوكي باستخدام الفرخ الجنينية

Abstract

توظيف عناصر محسن إلى محرك التعبير عن الجينات في الخلايا العصبية المراسل هو نموذج يستخدم على نطاق واسع لتعقب محواري الإسقاط. لتتبع من الإسقاط محواري interneurons الشوكي في الفقاريات ، والجينات الجرثومية مراسل خط استهداف العائد العلامات المتماثلة ثنائيا. لذلك ، فإنه من الصعب التمييز بين ipsi ومضاد أفقيا المحاوير إسقاط. electroporation من جانب واحد في الأنبوب العصبي الفرخ يوفر وسيلة مفيدة لتقييد حرية التعبير لجين مراسل لجانب واحد من الجهاز العصبي المركزي ، ومتابعة محواري الإسقاط على كلا الجانبين

Protocol

أولا Electroporation

التعامل مع البيض

1. تضع البيض في مجموعة حاضنة لترطيب 37-38 درجة مئوية ، ويفضل حاضنة مع الصواني هزاز.
2. وelectroporated الجنين بعد حوالي 66 ساعة من الحضانة ، وعندما وصلت همبرغر وهاميلتون (سمو) المرحلة 18-20. في هذه المرحلة يكمن في الرأس في زوايا الحق في الجذع (حالة تسمى الثنية عنق الرحم) ومجموعة واسعة من الأوعية الدموية خارج الجنينية ، مثل الأمامي ، ينظر الخلفي ، اليمين واليسار الأوردة المحية ينبغي أن يكون. هذه هي المرحلة المثلى لمحسن تعتمد على التعبير محددة ^1،3،4. من المهم رصد درجات الحرارة والرطوبة في الحاضنة ، من أجل الحصول على أجنة قابلة للحياة ومتزامنة.
3. بعد 66 ساعة من الحضانة ، وإزالة البيض من الحاضنة. وضع البيض أفقيا. انتظر 5-10 دقائق. الجنين الآن يقع في القطب العلوي من البيض.

التحضيرات

1. يعد حل هانك مع الستربتوميسين / البنسلين (P / S) (1:100 التخفيف).
2. سحب الزجاج الشعيرات الدموية (0.5 مم) لmicrocapillary.
3. وضع أقطاب كهربائية (التنجستن) في micromanipulator وتوصيل الأقطاب الكهربائية إلى مولد النبض (ECM 830).
4. ضبط مولد النبض مع المعلمات التالية : 30V الجهد ، وعدد من البقول -- 3 ، وطول 50 مللي النبض.
5. إعداد ماصة الفم ، إبرة حقنة وشريط.
6. تحضير خليط المرجوة من الحمض النووي (2-5μg/μl) وإضافة صبغة سريعة الأخضر.

النوافذ وelectroporation

1. باستخدام محقنة ، إزالة 5-6 مل من الألبومين من كل بيضة.
2. مع مقص صغير فتح النافذة البيضوية في الجانب العلوي من البيض.
3. رطبة الجنين مع 0.5 1ml هانك محلول P / S +.
4. استخدام ماصة الفم ، لتحميل microcapillary الزجاج مع مزيج الحامض النووي.
5. وضع الجنين مع ذيله نحوك. في هذه المرحلة ، يرى بوضوح الحبل الشوكي الجنين. وبالتالي ، فإن هناك حاجة إلى أساليب متباينة. غير مختومة الحبل الشوكي عند كلا الطرفين ، رأس وذيل ، ولكن إذا microcapillary الخاص رقيقة بما فيه الكفاية ، سوف تكون قادرة على ثقب وثقب صغير اختراق الأنبوب العصبي بزاوية ضحلة. يجب أن يتم تحميل وmicrocapillary بقطر الحق بسهولة مع الحمض النووي ، والتغلغل في أنبوب دون الإضرار بها والإفراج عن الحمض النووي مع الزفير العادية.
6. حقن الحمض النووي باستخدام ماصة الفم. وينبغي أن الصبغة الخضراء الممتدة من طرف الذيل يصل إلى الحويصلات من الدماغ النامية.
7. وضع أقطاب كهربائية في موازاة الأنبوب العصبي ، وقرب ما تستطيع ، دون لمس الأنبوب نفسه والنبض. في ذلك الوقت للنبض ، يجب أن تكون مشمولة الأقطاب مع السائل لسماحها التوصيل الكهربائي. عادة ، وكمية من هانك وأضاف في التسول كافية. إن لم يكن إضافة قطرة واحدة من قبيل هانك إلى النبض.
8. إزالة بعناية الأقطاب وختم النافذة مع شريط. فمن المهم لختم البيض تماما لمنع جفاف الجنين خلال فترة الحضانة التالية.
9. وضع البيض مرة أخرى في الحاضنة.

II. الحبل الشوكي مفتوح إعداد الكتاب

مفرزة من الحبل الشوكي من جنين

1. إزالة الجنين eletroporated ، في E6 ، من البيض ووضعه في طبق بتري المغلفة مع السيليكون التي تحتوي على برنامج تلفزيوني.
2. قطع بعيدا الأغشية وتمتد الجنين في بطني فريقه باستخدام دبابيس للسيطرة عليه.
3. باستخدام التنغستن حادة microcapillary إجراء شق طولي على طول سطح اللوحة ، من الدماغ المؤخر وصولا الى الذيل.
4. جعل إضافية اثنين من الشقوق الطولية في كلا الجانبين من الحبل الشوكي ، وفصل في العقد الجذرية الظهرية (DRGs) بعيدا عن الحبل الشوكي.
5. فصل لوحة الكلمة من النسيج بدءا من الذيل إلى الدماغ المؤخر ، وترك الحبل الشوكي سليمة.
6. قطع الحبل الشوكي في المقطع العرضي في الدماغ المؤخر باستخدام مقص الجميلة وفصلها عن الجسم.

تثبيت

1. انتشار الحبل الشوكي معزولة في طبق بتري الجديدة المغلفة مع السيليكون التي تحتوي على برنامج تلفزيوني ، وذلك باستخدام المسامير لأنه عقد ، من الدماغ المؤخر لانتاج مستحضر الذيل المسطح جبل.
2. صب برنامج تلفزيوني من الطبق واستبداله بارافورمالدهيد 4 ٪ في الفوسفات مخزنة المالحة.
3. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.

المناعية

1. نقل النخاع الشوكي الثابتة إلى قارورة تحتوي على الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني.
2. احتضان لطيف مع الثورات في أكثر من ليلة 4 درجات مئوية.
3. غسل جسم X5 مرات مع برنامج تلفزيوني ، كل يغسل لمدة 1 ساعة مع الثورات لطيف.
4. إضافة الضد الثانوية واحتضان مع الثورات لطيف طوال الليل في 4 درجات مئوية.
5. غسل جسم X5 مرات مع برنامج تلفزيوني ، كليغسل لمدة 1 ساعة مع الثورات لطيف.

كتاب مفتوح المتصاعدة للتصوير

1. الشحوم تشهير أو السيليكون في شكل مستطيل على شريحة وبالتنقيط في برنامج تلفزيوني.
2. مكان الحبل الشوكي امتدت في منتصف المستطيل باستخدام الملقط واستخلاص سوائل من حولها مع ماصة باستور.
3. مكان 1-2 قطرات من وسائل الاعلام المتزايدة على الحبل الشوكي ، وتغطي مع انزلاق الغطاء. الاسكواش لتفادي فقاعات الهواء.
4. الحفاظ على الشرائح في الظلام في 4 درجة مئوية.
5. فحص النخاع الشوكي باستخدام المجهر مبائر.

Discussion

Electroporation من الحمض النووي البلازميد في تطور الجنين الفرخ كأسلوب في التعبير قوية لحمل خارج الرحم الجسم الحي. مزيج من معززات محددة ، وفرخ electroporation يوفر أداة سريعة وفعالة لفك المسارات محواري من مجموعة محددة من الخلايا العصبية وراثيا ^1،3،5. ويمكن الاستفادة من لجنة المساواة العرقية / LoxP ونظم التضخيم Gal4/UAS زيادة مستويات ومدة التعبير. الصورة الناشئة من الاختلاف معقدة من الاشارات التي تنشأ من محواري عصبون المجموعات السكانية الفرعية ، التي يحددها اتجاه اسقاطاتها محواري. بالإضافة ، يمكن أن يتحقق في وقت واحد العلامات الجزيئية ومكانية محدودة اثنين من السكان الخلايا العصبية. وبالتالي ، وتوفير المعلومات حول بنية الدوائر العصبية ^3.