Dechiffrera axonal vägar genetiskt definierade grupper av nervceller i Chick Neural Tube Använda I ovo Elektroporation

Summary

Denna video visar hur du visualisera axonal vägar genetiskt definierade grupper av nervceller i embryonala ungen ryggmärgen att utnyttja

Abstract

Anställning av förstärkare element för att driva uttryck av reportern gener i nervceller är en allmänt använd paradigm för spårning axonal projektion. För spårning axonal projicering av spinal interneuronen hos ryggradsdjur, könscellernas riktade reporter gener ger bilateralt symmetrisk märkning. Därför är det svårt att skilja mellan ipsi-och kontraindikationer sidled utskjutande axoner. Ensidig elektroporation i ungen neuralröret ger ett användbart sätt att begränsa uttrycket av en reporter gen till ena sidan av det centrala nervsystemet, och att följa axonal projektion på båda sidor

Protocol

I. elektroporation

Egg hantering

1. Lägg äggen i en fuktad inkubator inställd på 37-38 ° C, helst en inkubator med en gungande brickor.
2. Embryo är electroporated efter ca 66 timmar inkubation, när de har nått Hamburger & Hamilton (HH) stadium 18-20. I detta skede huvudet ligger vinkelrätt mot stammen (tillstånd som kallas livmoderhalscancer fotled) och en stor uppsättning extra embryonala blodkärl, såsom främre bör bakre, höger och vänster vitelline vener sett vara. Detta är en optimal scen för förstärkare beroende specifikt uttryck ^1,3,4. Det är viktigt att övervaka temperatur och luftfuktighet i inkubatorn, för att få livskraftiga och synkroniserade embryon.
3. Efter 66 timmars inkubation, ta bort ägg från inkubatorn. Placera äggen horisontellt. Vänta 5-10 minuter. Embryot nu ligger på den övre polen av ägget.

Förberedelser

1. Förbered Hanks lösning med penicillin / streptomycin (P / S) (1:100 utspädning).
2. Dra glas kapillärer (0,5 mm i diameter) till microcapillary.
3. Placera elektroderna (tungsten) i mikromanipulator och anslut elektroderna till pulsgeneratorn (ECM 830).
4. Justera pulsgenerator med följande parametrar: spänning 30V, antal pulser - 3, längd puls 50 ms.
5. Förbered en mun pipett en spruta nål och ett band.
6. Förbered en önskad blandning av DNA (2-5μg/μl) och lägga en snabb grön färg.

Fönstersystem och elektroporation

1. Med hjälp av en spruta, ta bort 5-6 ml albumin från varje ägg.
2. Med en liten sax öppna ett ovalt fönster i den övre delen av ägget.
3. Fuktig embryot med 0,5-1ml Hanks + P / S-lösning.
4. Använd en mun pipett för att ladda glaset microcapillary med DNA blandning.
5. Placera embryo med sin svans mot dig. I detta skede är embryots ryggmärgen tydligt. Därför finns inga kontrasterande teknik som krävs. Ryggmärgen är förseglad i båda ändar, huvudet och svansen, men om din microcapillary är tunn nog, kommer du att kunna punktera ett litet hål och penetrerar neuralröret i en flack vinkel. En microcapillary av rätt diameter ska laddas enkelt med DNA, penetrera röret utan att skada den och släppa DNA med en vanlig utandning.
6. Injicera DNA med en mun pipett. Den gröna färgen bör spridas från spetsen av svansen upp till vesikler i den växande hjärnan.
7. Placera elektroderna parallellt med neuralrörsdefekter, så nära som du kan, utan att vidröra röret själv och puls. Vid tiden för pulsen, måste elektroderna täckas med vätska för att tillåta elektrisk ledningsförmåga. Vanligtvis är mängden Hanks läggas till i tiggeri tillräcklig. Om inte lägger en droppe av Hank är precis innan pulsen.
8. Ta försiktigt bort elektroderna och täta fönster med ett band. Det är viktigt att täta ägget helt och hållet för att förhindra uttorkning av embryot under den följande inkubationstiden.
9. Placera ägget tillbaka i inkubatorn.

II. Ryggmärgen öppen bok förberedelse

Avlossning av ryggmärgen från embryo

1. Ta bort eletroporated embryot, vid E6, från ägg och placera den i en petriskål belagd med silikon som innehåller PBS.
2. Skär bort hinnor och sträck embryot på sin ventralsidan med stift för att hålla den.
3. Med en vass volfram microcapillary gör en längsgående snitt längs takplåt, från hindbrain ner till svansen.
4. Gör ytterligare två längsgående snitt på båda sidor av ryggmärgen, loss dorsalrotsganglier (DRG) från ryggmärgen.
5. Lossa golvet plattan från vävnad från svansen till hindbrain, lämnar ryggmärgen intakt.
6. Klipp ryggmärgen i ett tvärsnitt på hindbrain med fina sax och skilja den från kroppen.

Fixering

1. Sprid den isolerade ryggmärgen i en ny petriskål belagd med silikon som innehåller PBS, med stift för att hålla det, från hindbrain till svansen producera en platt-mount beredning.
2. Häll PBS från skålen och ersätta den med 4% paraformaldehyd i fosfatbuffrad saltlösning.
3. Inkubera vid rumstemperatur i 1 timme.

Immunohistokemi

1. Överför fast ryggmärgen i en injektionsflaska som innehåller primära antikroppen i PBS.
2. Inkubera med mjuka agitationer över natten vid 4 ° C.
3. Tvätta antikroppen X5 gånger med PBS, varje tvätt för en timme med mild agitationer.
4. Lägg sekundär antikropp och inkubera med mild agitationer över natten vid 4 ° C.
5. Tvätta antikroppen X5 gånger med PBS, varjetvätt för en timme med mild agitationer.

Montering öppen bok för avbildning

1. Smeta fett eller silikon i en rektangel form på en bild och droppa PBS inom.
2. Placera ryggmärgen sträcks i mitten av rektangeln med hjälp av pincett och dra ut vätskan runt den med en pasteurpipett.
3. Plats 1-2 droppar montering media på ryggmärgen och täck med lock halka. Squash den för att undvika luftbubblor.
4. Förvara bilderna i mörker i 4 ° C.
5. Inspektera ryggmärgen med hjälp av konfokalmikroskopi.

Discussion

Elektroporation av plasmid DNA i kycklingembryo utvecklas som en kraftfull teknik för in vivo ektopiska uttryck. Kombinationen av specifika medel, och bruden elektroporation ger en snabb och effektivt verktyg för att dechiffrera axonal vägar av en genetiskt definierad grupp av nervceller ^1,3,5. Använda Cre / LoxP och Gal4/UAS system förstärkningen kan öka nivåerna och varaktigheten av uttryck. Den nya bilden är av en komplex skillnaderna mellan axonal signaler som uppstår interneuron subpopulationer, som definieras av den riktning de axonal prognoser. Dessutom kan samtidig molekylära och rumsliga begränsad märkning av två neuronpopulationer uppnås. Således ge information om arkitekturen i neuronala kretsar ^3.