Summary
इस वीडियो को दर्शाता है कैसे भ्रूण लड़की रीढ़ की हड्डी उपयोग की हड्डी में न्यूरॉन्स की आनुवंशिक रूप से परिभाषित समूहों के axonal रास्ते कल्पना करने के लिए
Abstract
रोजगार बढ़ाने तत्वों के न्यूरॉन्स में रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति ड्राइव axonal प्रक्षेपण पर नज़र रखने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रतिमान है. रीढ़ में रीढ़ की हड्डी interneurons की axonal प्रक्षेपण पर नज़र रखने के लिए, रोगाणु लाइन लक्षित रिपोर्टर जीन द्विपक्षीय सममित लेबलिंग उपज. इसलिए, यह ipsi और विपरीत laterally पेश axons के बीच भेद करना मुश्किल है. लड़की न्यूरल ट्यूब में एकतरफा electroporation एक उपयोगी साधन प्रदान करता है केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के एक तरफ करने के लिए एक पत्रकार के जीन की अभिव्यक्ति को सीमित करते हैं, और दोनों पक्षों पर axonal प्रक्षेपण का पालन
Protocol
मैं electroporation
अंडे से निपटने
- 37-38 डिग्री सेल्सियस बेहतर, एक कमाल की ट्रे के साथ एक मशीन एक humidified इनक्यूबेटर सेट में अंडे रखें.
- भ्रूण ऊष्मायन के बारे में 66 घंटे के बाद electroporated हैं, जब वे हैम्बर्गर और हैमिल्टन (एच एच) 18-20 चरण तक पहुँच चुके हैं. इस अवस्था में सिर सही कोण पर ट्रंक (ग्रीवा वंक बुलाया हालत) और अतिरिक्त भ्रूण पूर्वकाल, पीछे, सही है और छोड़ दिया vitelline नसों में देखा जाना चाहिए जैसे रक्त वाहिकाओं, की एक विशाल सेट के लिए निहित है. यह बढ़ाने पर निर्भर विशिष्ट 1,3,4 अभिव्यक्ति के लिए एक इष्टतम मंच है . इनक्यूबेटर तापमान और आर्द्रता की निगरानी करने के लिए, क्रम में करने के लिए व्यवहार्य और सिंक्रनाइज़ भ्रूण प्राप्त है यह महत्वपूर्ण है.
- ऊष्मायन के 66 घंटे के बाद, अंडे इनक्यूबेटर से हटा दें. क्षैतिज अंडे प्लेस. 5-10 मिनट रुको. भ्रूण अब अंडे के ऊपरी पोल पर स्थित है.
तैयारी
- पेनिसिलिन / (पी / एस) स्ट्रेप्टोमाइसिन (1:100 कमजोर पड़ने) के साथ हांक समाधान तैयार है.
- ग्लास (0.5 मिमी व्यास) capillaries को microcapillary खींचो.
- Micromanipulator में इलेक्ट्रोड (टंगस्टन) प्लेस और पल्स जनरेटर (830 ईसीएम) इलेक्ट्रोड कनेक्ट.
- - 3, नाड़ी 50 एमएस की लंबाई वोल्टेज 30V, दालों की संख्या: निम्न पैरामीटर के साथ पल्स जनरेटर को समायोजित करें.
- एक मुँह पिपेट, एक सिरिंज सुई और एक टेप तैयार.
- डीएनए (2-5μg/μl) के एक वांछित मिश्रण तैयार है और एक फास्ट ग्रीन डाई जोड़ें.
Windowing और electroporation
- एक सिरिंज का प्रयोग, albumin की 5-6 मिलीलीटर प्रत्येक अंडे से हटा दें.
- के साथ एक छोटी सी कैंची अंडे के ऊपरी पक्ष में एक अंडाकार खिड़की खुला.
- 0.5 1ml हांक + समाधान पी / एस के साथ नम भ्रूण.
- एक मुँह विंदुक का प्रयोग करें, लोड करने के लिए डीएनए मिश्रण के साथ कांच microcapillary.
- आप की ओर अपनी पूँछ के साथ भ्रूण रखें. इस अवस्था में भ्रूण की रीढ़ की हड्डी में स्पष्ट रूप से देखा है. इसलिए, कोई विषम तकनीक आवश्यक हैं. रीढ़ की हड्डी के दोनों समाप्त होता है, सिर और पूंछ पर बंद है, लेकिन अगर आपके microcapillary काफी पतली है, आप एक छोटे छेद पंचर करने में सक्षम हो सकता है और एक उथले कोण पर न्यूरल ट्यूब घुसना होगा. सही व्यास का एक microcapillary आसानी से डीएनए के साथ लोड किया जाना चाहिए, यह नुकसान पहुँचाए बिना ट्यूब घुसना है और एक नियमित रूप से साँस छोड़ना के साथ डीएनए रिलीज.
- एक मुँह पिपेट का उपयोग डीएनए इंजेक्षन. हरे रंग पूंछ के विकासशील मस्तिष्क के vesicles के टिप से फैल चाहिए.
- न्यूरल ट्यूब करने के लिए समानांतर में इलेक्ट्रोड के रूप में निकट के रूप में आप कर सकते हैं, ट्यूब और ही नाड़ी छू के बिना, प्लेस. नाड़ी के समय विद्युत चालकता की अनुमति के लिए, इलेक्ट्रोड तरल के साथ कवर किया जाना चाहिए. आमतौर पर, हांक भीख माँग पर जोडी की राशि पर्याप्त है. यदि नहीं हांक बस नब्ज को पहले की एक बूंद जोड़ें.
- ध्यान इलेक्ट्रोड हटाने और एक टेप के साथ खिड़की सील. यह अंडे पूरी तरह से सील करने के लिए निम्न ऊष्मायन अवधि के दौरान भ्रूण के सूखने से रोकने के महत्वपूर्ण है.
- अंडे इनक्यूबेटर में वापस प्लेस.
द्वितीय. रीढ़ की हड्डी की तैयारी की हड्डी किताब खुला
रीढ़ की हड्डी के भ्रूण से टुकड़ी
- निकालें eletroporated भ्रूण E6 में, अंडे से है और यह एक पेट्री डिश में पीबीएस युक्त सिलिकॉन के साथ लेपित जगह है.
- दूर झिल्ली कट और अपने उदर पिन का उपयोग करने के लिए इसे पकड़ तरफ भ्रूण खिंचाव.
- एक तेज टंगस्टन का उपयोग पूंछ के लिए नीचे hindbrain से छत की थाली के साथ एक अनुदैर्ध्य चीरा, microcapillary.
- रीढ़ की हड्डी के दोनों पक्षों पर एक अतिरिक्त दो अनुदैर्ध्य चीरों बनाओ, पृष्ठीय रूट ganglia (DRGs) detaching रीढ़ की हड्डी से दूर है.
- अलग पूंछ से hindbrain करने के लिए शुरू के ऊतकों से फर्श की थाली, रीढ़ की हड्डी को अक्षुण्ण जा.
- ठीक कैंची का उपयोग hindbrain पर एक अनुप्रस्थ अनुभाग में रीढ़ की हड्डी कट और यह शरीर से अलग.
फिक्सेशन
- एक नया पेट्री सिलिकॉन पीबीएस युक्त, पिन का उपयोग करने के लिए इसे पकड़ hindbrain से पूंछ के लिए एक फ्लैट माउंट तैयारी उत्पादन, के साथ लेपित पकवान में अलग रीढ़ की हड्डी में बिखरा हुआ है.
- पकवान से पीबीएस डालो और फॉस्फेट buffered खारा में 4% paraformaldehyde के साथ बदलें.
- 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
Immunohistochemistry
- पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त शीशी में तय की रीढ़ की हड्डी में स्थानांतरण.
- 4 में रात खत्म कोमल आंदोलन के साथ सेते डिग्री सेल्सियस
- पीबीएस के साथ एंटीबॉडी X5 बार, कोमल आंदोलन के साथ 1 घंटे के लिए प्रत्येक धो धो लें.
- माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें और 4 में रात खत्म कोमल आंदोलन के साथ सेते डिग्री सेल्सियस
- पीबीएस के साथ एंटीबॉडी X5 बार धो, प्रत्येककोमल आंदोलन के साथ 1 घंटे के लिए धो लो.
इमेजिंग के लिए बढ़ते खुली किताब
- स्मियर तेल या एक स्लाइड पर एक आयत के आकार में सिलिकॉन और भीतर पीबीएस ड्रिप.
- रीढ़ की चिमटी और पाश्चर विंदुक के साथ तरल आकर्षित यह चारों ओर का उपयोग आयत के बीच में बढ़ाकर कॉर्ड रखें.
- रीढ़ की हड्डी पर बढ़ते मीडिया की 1-2 बूँदें प्लेस और कवर पर्ची के साथ कवर. स्क्वैश यह हवाई बुलबुले से बचने के लिए.
- डिग्री सेल्सियस 4 में अंधेरे में स्लाइड्स रखो
- रीढ़ की हड्डी की हड्डी का उपयोग confocal माइक्रोस्कोपी निरीक्षण किया.
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Discussion
लड़की भ्रूण में डीएनए प्लाज्मिड के electroporation vivo में अस्थानिक अभिव्यक्ति में एक शक्तिशाली तकनीक के रूप में विकसित. विशिष्ट enhancers, और लड़की electroporation के संयोजन 1,3,5 न्यूरॉन्स की आनुवंशिक रूप से परिभाषित समूह के axonal रास्ते के गूढ़ रहस्य के लिए एक त्वरित और कुशल उपकरण प्रदान करता है. उपयोग Cre / LoxP और Gal4/UAS प्रवर्धन प्रणाली स्तर और अभिव्यक्ति की अवधि बढ़ाने कर सकते हैं. उभरते चित्र axonal संकेत है कि interneuron subpopulations, उनके axonal अनुमानों के दिशा द्वारा परिभाषित से उठता है की एक जटिल विचलन के है. इसके अलावा, एक साथ दो neuronal आबादी की आणविक और स्थानिक प्रतिबंधित लेबलिंग प्राप्त किया जा सकता है. इस प्रकार, neuronal 3 सर्किट के वास्तुकला के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं.
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Acknowledgments
इस काम में इसराइल विज्ञान फाउंडेशन, इसराइल के स्वास्थ्य मंत्रालय, और DFG (जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) से एके अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
References
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