Summary
大鼠MSCs从股骨和胫骨分离，然后通过磁性细胞分选富集。排序细胞被证实为流式细胞仪检测表面标志物表达。这些细胞克隆密度培养，形成单菌落，然后这些菌落克隆气瓶分开。
Abstract
干细胞是一个成人干细胞的人口，这是一个治疗应用前途源。这些细胞可以从骨髓中分离，可以很容易地从造血干细胞（HSCs）由于塑料坚持分开。此协议介绍了如何从大鼠股骨和胫骨的干细胞分离。分离出的细胞对两个干细胞表面标志物CD54和磁性细胞分选CD90的进一步丰富。表面标志物CD54和CD90的表达，然后通过流式细胞仪分析证实。 HSC的标记CD45的也包括在内，以检查是否排序干细胞，造血干细胞耗尽。干细胞是自然相当异构。有不同的形状，增殖和分化能力的细胞亚群。所有这些亚群表达已知的干细胞标记，并没有独特的标记尚未确定不同的亚群。因此，分离出不同的亚群的一种替代方法是使用克隆气瓶分离出单细胞集落来源的细胞。然后可以从单一的殖民地所得的细胞培养和单独评价。
Protocol
1。大鼠MSCs的分离
从6-8周龄只Sprague - Dawley雌性大鼠如前所述1，2间质干细胞分离。隔离的MSCs能坚持到塑料表面，并轻松地扩展在体外培养。
- 动物被放入一个麻醉室，麻醉，大约5分钟。在麻醉，观察闪烁，呼吸和运动活动的速度。立即从腔中取出的动物后，停止电机活动，成为罕见的闪烁速率。
- 打下的动物，一个操作站上颈椎脱位并杀死动物。切断从后面肢体的股骨和胫骨，去除皮肤和肌肉。
- 70％异丙醇几秒钟解剖股骨和胫骨，并转移到1X的D - PBS。
- 在生物安全柜，股骨和胫骨被转移到一个10厘米菜的DMEM。每个骨骼，然后用镊子举行，并用剪刀打开两端被切断。将一个22G的针头到3毫升注射器和填充用DMEM，然后冲入一个50毫升管插入一个开口端的骨针的骨髓。重复2〜3倍，每块骨骼。当所有的骨髓获得，悬浮细胞，并通过一个70μm细胞过滤器的细胞悬液，以去除骨碎片和血液总量。
- 离心200克细胞，4℃5分钟，取出吸上清液。于25ml MSC介质的悬浮细胞（DMEM含10％胎牛血清和1％的笔链球菌）。 10ml细胞悬浮液中接种到每一个10cm的培养皿中，共两道菜。 1〜2周保持在37℃和5％的CO 2培养箱培养皿。换液，每隔2〜3天。
2。富集大鼠MSCs
已被用于一些表面蛋白，以丰富的干细胞，包括CD54，CD90，CD73，CD105和CD271 3-5 。在我们的研究中，我们作为标记CD54和CD90，以丰富磁性细胞分选干细胞。
- 当细胞达到80％左右汇合，吸出培养基，添加4〜5毫升胰蛋白酶EDTA每一道菜。把菜肴的孵化器和孵化约5分钟，以使细胞脱落。一旦细胞分离，加等量的培养基灭活胰蛋白酶。收集到一个15毫升管和自旋细胞，细胞悬液200克，4℃5分钟。
- 接下来的步骤描述如何充实两个表面标志物CD54和CD90干细胞，根据细胞分离使用屋宇署IMagnet手册。悬浮细胞沉淀在细胞染色缓冲液（3％热灭活FBS 1X的D - PBS）为20万细胞/ ml。添加生物素标记的CD54抗体（0.25μg每百万个细胞）和生物素标记的CD90抗体（0.15μg每百万个细胞），轻轻混合细胞悬液。冰15分钟的潜伏期后，标记的细胞被洗净，用1X BD IMAG缓冲区的过剩量。标记的细胞被降速200克，4℃5分钟。
- 涡屋宇署IMAG链霉亲和素粒子彻底，加40μl颗粒每10万个单元格。彻底标记细胞混合粒子和细胞孵育6〜12℃30分钟。这允许绑定到链霉亲和颗粒的生物素标记的抗CD54和抗CD90，这是必然的表面蛋白CD54和CD90分别。
- 在孵化时，标签的圆底试管收集的积极的一小部分。孵化后，将标签卷20万个细胞/毫升1X屋宇署IMAG缓冲区和标记细胞转移到积极的馏分收集管。放置到BD IMagnet的积极的一小部分管，并让它停留6分钟，然后取出上清液用玻璃巴斯德吸管的积极的一小部分管的BD IMagnet仍然。
- 屋宇署IMagnet的积极的一小部分管取出，并置于冰上。添加1毫升冰冷1X屋宇署IMAG缓冲区，并轻轻搅拌悬浮细胞。管放置到BD IMagnet并让它留2〜4分钟。取出上清液用一个新的玻璃巴斯德吸管。重复洗涤2.5之一更多的时间。
- 删除屋宇署IMagnet和悬浮细胞培养液中，种子之一75厘米2瓶维持细胞和流式细胞仪10厘米菜管。
3。流式细胞仪检测表面标志表达的验证
流式细胞仪分析，以验证我们得到的细胞表达CD54和CD90。 HSC的标记CD45的被用来证实，干细胞造血干细胞耗尽。
- 当细胞成为〜80％汇合，trypsinize用胰蛋白酶- EDTA的细胞，并收集到一个15毫升管细胞。在200克，4 ° C下5分钟离心收集细胞。
- 吸弃上清液，并H细胞与1X的D - PBS一次。悬浮细胞在细胞染色缓冲液（1X的D - PBS含2％FBS和0.05％叠氮钠）的终浓度为5〜10万细胞/毫升，并保持在冰上的细胞。 （; 2亚型控制IgG2a;。3同型对照IgG1的; CD45; 5 CD54的; 6 CD90细胞只）分装100微升到6个标记的试管中的细胞悬液。
- 添加适当浓度的同型对照和初级抗体（IgG2a和IgG1：20μL，每百万个细胞; CD45：0.5μg每百万个细胞; CD54：0.25μg每百万个细胞; CD90：0.15μg每百万个细胞），并在4 ° C孵育30分钟。
- 1X的D - PBS洗涤细胞两次，然后悬浮细胞100μL细胞染色缓冲。新增的SA - PE（藻红蛋白链霉菌，使用每百万个细胞0.15μg）和孵育4℃30分钟，在黑暗的彗星。
- 1X的D - PBS清洗两次标记的细胞。在400μl细胞染色缓冲液重悬细胞，流式细胞仪分析和转让猎鹰管。
4。衍生的干细胞分离单细胞集落
干细胞是一种异质性的人口与不同的细胞形态，生长速度以及分化能力6的不同亚群组成。然而，所有的亚群表达称为MSC的标记，因此它是不可行的使用标记分离出这些亚群。因此，我们应用克隆气瓶分离出不同的亚群，这是由单细胞组成的殖民地。
- 在大约50〜100个细胞10厘米菜板细胞。在37℃和5％CO 2培养箱中孵育1〜2周。在此期间，研究倒置显微镜以及孤立的殖民地。一旦殖民地已经达到了足够大的尺寸（更好的超过100个细胞在每一个殖民地），马克在盘底部sharpie的殖民地。当挑选标明的殖民地，确保附近捡到一个有没有周围的殖民地。
- 吸中期和1X的D - PBS洗一次菜。拿起无菌克隆气缸，用无菌镊子轻轻周围放置标记的殖民地。重复此标记的殖民地，直到所有克隆缸放置在。挑选菌落应远离对方，每一个克隆缸只包含一个殖民地。
- 加入100μL胰蛋白酶EDTA每个克隆缸，并把这道菜〜5分钟的孵化器。 5分钟后，细胞在显微镜下检查，看看他们是否四舍五入。当细胞有向上抬起，加等量的培养基灭活胰蛋白酶。用200μL移液器混合细胞悬液，细胞悬液转移到60毫米菜含有3毫升预热培养基。标签正确的菜，放入孵化器。在未来数天的跟踪形态变化。
5。代表性的成果
据塑料贴壁细胞在大鼠MSCs隔离的一部分描述的协议，应该是可见的镀后的第二天。当细胞继续增殖，看起来应该像图1A所示的细胞融合细胞。当细胞到达〜80％汇合（图1B），传代，可以进行。在继代培养，胰蛋白酶EDTA用于分离细胞和解除细胞小而圆图1C所示。
图1。大鼠MSCs的相衬图像。 （一）聚合MSCS。多数细胞的纺锤状或明星般的。 （二）干细胞在80％左右汇合。 （三）解除后胰蛋白酶的细胞小而圆。
一旦干细胞富集磁性细胞分选，流式细胞仪分析，以验证表面标志表达。如果浓缩是好的，细胞显示对HSC的标记CD45（图2）对MSC的标志物CD54和CD90阳性染色阴性。同型对照IgG2a和IgG1被用来作为阴性对照。
图2。流干细胞表面标志的流式细胞仪分析 。MSCs的标记与IgG2a，IgG1的（2亚型控制）（同型对照1），CD45，CD54和CD90抗体。干细胞表达CD54和CD90，但不CD45的。
当种子细胞在适当的克隆密度，菌落上升，从单细胞。图3A代表一个单细胞形成一个殖民地。克隆气瓶然后可以用来单独来自殖民地的殖民地和细胞可单独培养。图3B和3C代表从两个独立的殖民地衍生细胞。从殖民地1派生的细胞主轴像（图3B），而从殖民地2所产生的细胞是圆形（图3C）。
图3。干细胞和单细胞集落来源的细胞集落形成。干细胞培养克隆密度形成单个菌落。这些殖民地可以分离克隆气瓶和细胞从不同的殖民地，可以单独培养。 （A）代表菌落形成干细胞克隆密度电镀时。 （二）梭形细胞派生从一个殖民地。 （三）圆形细胞来自另一个殖民地。
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Discussion
本协议描述了如何隔离和丰富的MSCs。一个分开的单细胞集落来源的细胞的方法也纳入其中。有几个步骤，是一个成功的分离，浓缩和殖民地分离的重要。虽然从大鼠细胞分离，这是建议通过细胞过滤器或类似大小的无菌尼龙网，清除血块和骨碎片的过滤器。电镀后的细胞在一夜之间，许多死细胞，将浮在中期和去除死细胞更换新鲜培养基，这应有助于贴壁细胞的生长。
磁性细胞，在这个协议中的排序描述如何执行积极的选择，并且可以使用类似的程序来执行一个负选择。要添加的抗体量可能会有所不同，需要优化，以达到更好的排序。这也是真正的标记流式细胞仪分析细胞。如果没有运行标记的样品立即流式细胞仪分析，样品可以用2％甲醛固定，并在以后运行。然而，长期储存不建议，因为这会增加自体荧光和牺牲样品质量。
殖民地分离的关键部分是在合适的细胞密度播种（这应该是优化实验）和定位不是由其他克隆包围的单一克隆。如果附近有其他克隆，克隆缸可能包括附近的克隆，获得的细胞将不再从一个克隆。当放置在克隆的克隆缸，也可以小心滑过盘表面，因为这会导致克隆缸底部硅脂覆盖细胞和深远的细胞分离，防止胰蛋白酶。
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Acknowledgments
这项工作是支持部分由国立卫生研究院（R01GM079688，R21RR024439，R21GM075838），美国国家科学基金会（CBET 0941055）和密歇根州立大学基金会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Biotin mouse IgG2a | BD Biosciences | 555572 | |
| Biotin mouse IgG1 | BD Biosciences | 555747 | |
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | |
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | |
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | |
| BD Imag buffer | BD Biosciences | 552362 | |
| Round-bottom tube | BD Biosciences | 352063 | |
| Streptavidin particles | BD Biosciences | 557812 | |
| SA-PE | R&D Systems | F0040 | |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C2059 |
References
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