के निषेचन Xenopus oocytes होस्ट स्थानांतरण विधि का उपयोग
Summary
Fertilizing के लिए प्रक्रिया<em> Xenopus oocytes</em> मेजबान हस्तांतरण विधि के द्वारा.
Abstract
मातृ प्रभाव उत्परिवर्ती पशुओं को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक समय और खर्च से माता से विरासत में मिला अणुओं के योगदान के अध्ययन के प्रारंभिक विकास हड्डीवाला अक्सर आड़े आती है. इसके अतिरिक्त, तकनीक के कई overexpress या Xenopus और zebrafish जैसे जीवों में जीन समारोह को बाधित करने के लिए पर्याप्त महत्वपूर्ण WNT सिगनल के रूप में मातृ संकेत रास्ते, लक्ष्य असफल. Xenopus में, सुसंस्कृत oocytes में जीन समारोह से छेड़छाड़ और बाद में उन्हें fertilizing इन समस्याओं को कुछ हद तक उन्नति कर सकते हैं . Oocytes मैन्युअल रूप से दाता अंडाशय के ऊतकों से defolliculated हैं, इंजेक्शन या संस्कृति में इलाज के रूप में वांछित है, और तो प्रोजेस्टेरोन के साथ उत्तेजित करने के लिए परिपक्वता प्रेरित. अगला, oocytes एक ovulating मेजबान महिला मेंढक का शरीर गुहा में पेश कर रहे हैं, जिस वे मेजबान oviduct के माध्यम से translocated हो जाएगा और संशोधनों और जेली कोट निषेचन के लिए आवश्यक प्राप्त है. परिणामस्वरूप भ्रूण तब इच्छित मंच पर उठाया कर सकते हैं हो सकता है और किसी भी प्रयोगात्मक perturbations के प्रभाव के लिए विश्लेषण किया. यह मेजबान हस्तांतरण विधि जल्दी विकास के बुनियादी तंत्र uncovering में अत्यंत प्रभावी किया गया है और प्रयोगात्मक किसी भी अन्य हड्डीवाला मॉडल जीव में उपलब्ध नहीं है संभावनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला की अनुमति देता है.
Protocol
Discussion
एक सफल निषेचन और> oocytes की 50% (चित्रा 3) के सामान्य विपाटन हस्तांतरण में परिणाम होगा. हस्तांतरित oocytes के आम तौर पर बीच 30-60% neurula चरणों पिछले बच जाएगा. हम आम तौर पर 75-150 oocytes प्रति प्रायोगिक समूह (बगल में, RT-पीसीआर) के रूप ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए ह्यूस्टन प्रयोगशाला का धन्यवाद सदस्यों के लिए करना चाहते हैं. अनुसंधान द्वारा समर्थित राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के (GM083999) DWH सम्मानित किया है
Materials
Solutions and recipes:
OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)
| 70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine) | (Invitrogen 11415-064) |
| 0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V) | (Sigma A-9418-50g) |
| 1x Penicillin-Streptomycin | (Sigma P-0781) |
| Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH | |
| Make fresh weekly, store at 18°C. | |
10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)
| 1M NaCl |
| 20 mM KCl |
| 20 mM CaCl2 |
| 10 mM MgCl2 |
| 150 mM HEPES |
| adjust to pH 7.6-7.8 |
| Store at 4°C |
Anesthetic solution
| 1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222) | (Sigma A-5040) |
| 0.7 g/L sodium bicarbonate | |
| Dissolve in Amquel-treated water | |
| Make fresh weekly | |
Progesterone stocks
| 10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol |
| Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution |
| Store at -20°C |
Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)
| Blue: 0.1% Nile Blue A | (Aldrich 121479-5G), |
| Red: 0.25% Neutral Red | (Sigma N-6634), |
| Brown: 1% Bismarck Brown | (Sigma B-2759), |
| Green (80 μl blue + 80 μl brown), | |
| Mauve (80 μl blue + 80 μl red). | |
| A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown. | |
Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.
References
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