Procedimento para fertilizar<em> Oócitos Xenopus</em> Pelo método de transferência de host.
Estudar a contribuição de moléculas herdada da mãe para o desenvolvimento inicial dos vertebrados é frequentemente prejudicada pelo tempo e despesa necessária para gerar animais mutantes efeito materno. Além disso, muitas das técnicas para superexpressão ou inibir a função do gene em organismos como Xenopus e zebrafish não suficientemente alvo crítico materna vias de sinalização, tais como sinalização Wnt. Em Xenopus, manipulando a função do gene em oócitos cultivados e, posteriormente, fecundá-los pode amenizar esses problemas até certo ponto. Ovócitos são manualmente defolliculated de tecido de ovário doador, injetado ou tratados de cultura como desejado, e então estimulados com progesterona para induzir a maturação. Em seguida, os oócitos são introduzidos na cavidade do corpo de um sapo anfitrião ovulando feminino, quando então eles serão translocados através do oviduto do hospedeiro e adquirir modificações e casacos de geléia necessário para a fertilização. Os embriões resultantes podem então ser aumentado para o estágio desejado e analisadas para os efeitos de quaisquer perturbações experimental. Este método de transferência de anfitrião tem sido altamente eficaz em descobrir mecanismos básicos do desenvolvimento inicial e permite uma ampla gama de possibilidades experimentais não disponíveis em qualquer outro organismo vertebrado modelo.
A transferência bem sucedida irá resultar na fertilização e clivagem normal de> 50% dos oócitos (Figura 3). Geralmente entre 30-60% dos oócitos transferidos sobreviverá após os estágios nêurula. Nós normalmente transferência 75-150 oócitos por grupo experimental, que vai produzir embriões suficientes para vários tipos de análise (in situ, RT-PCR), bem como visualizar o fenótipo. Implantação de ovócitos substancialmente mais não parece aumentar significativamente o rendimento. Além disso, pelo me…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer os membros do laboratório de Houston para a leitura crítica do manuscrito. Pesquisa é apoiada pelo National Institutes of Health (GM083999) concedido a DWH
Solutions and recipes:
OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)
70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine) | (Invitrogen 11415-064) |
0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V) | (Sigma A-9418-50g) |
1x Penicillin-Streptomycin | (Sigma P-0781) |
Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH | |
Make fresh weekly, store at 18°C. |
10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)
1M NaCl |
20 mM KCl |
20 mM CaCl2 |
10 mM MgCl2 |
150 mM HEPES |
adjust to pH 7.6-7.8 |
Store at 4°C |
Anesthetic solution
1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222) | (Sigma A-5040) |
0.7 g/L sodium bicarbonate | |
Dissolve in Amquel-treated water | |
Make fresh weekly |
Progesterone stocks
10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol |
Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution |
Store at -20°C |
Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)
Blue: 0.1% Nile Blue A | (Aldrich 121479-5G), |
Red: 0.25% Neutral Red | (Sigma N-6634), |
Brown: 1% Bismarck Brown | (Sigma B-2759), |
Green (80 μl blue + 80 μl brown), | |
Mauve (80 μl blue + 80 μl red). | |
A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown. |
Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.