La fertilización de Oocitos de Xenopus Utilizando el método de transferencia de acogida

Summary

Procedimiento para la fertilización<em> Oocitos de Xenopus</em> Por el método de transferencia de acogida.

Abstract

Estudiar la contribución de las moléculas de herencia materna a la vertebración de desarrollo temprano a menudo se ve obstaculizada por el tiempo y los gastos necesarios para generar animales de la madre y el efecto mutante. Además, muchas de las técnicas para sobreexpresar o inhiben la función de genes en organismos tales como Xenopus y pez cebra no objetivo suficientemente crítica materna vías de señalización, como la señalización de Wnt. En Xenopus, la manipulación de la función de genes en ovocitos cultivados y su posterior fertilización puede mejorar estos problemas hasta cierto punto. Los ovocitos son manualmente defolliculated de tejido de un donante de ovario, inyectado o tratado en la cultura como se desee, y luego estimulados con progesterona para inducir la maduración. A continuación, los ovocitos se introducen en la cavidad del cuerpo de una rana anfitrión ovulación femenina, con lo cual se trasladaron a través del oviducto del anfitrión y adquirir las modificaciones y abrigos de gelatina necesaria para la fecundación. Los embriones resultantes se puede elevar a la fase deseada y se analizaron los efectos de cualquier perturbación experimental. Este método de transferencia de acogida ha sido muy eficaz en el descubrimiento de los mecanismos básicos del desarrollo inicial y permite una amplia gama de posibilidades experimentales no están disponibles en cualquier organismo vertebrado otro modelo.

Protocol

1. La extirpación quirúrgica de tejido ovárico Preparar un nuevo lote de medio de cultivo de ovocitos (OCM; Materiales), entre 400-800 ml, dependiendo del tamaño del experimento. Ajustar el pH a 7,6-7,8, hasta que el rojo fenol se vuelve un color rojo oscuro (seis o más gotas de NaOH 5 N). Vierta una pequeña cantidad para comprobar el pH en un tubo separado desde el electrodo de pH pueden contaminar los medios de comunicación. OCM deben ser almacenados a 18 º C y utilizarse dentro de un…

Discussion

Un éxito de la transferencia dará lugar a la fecundación y la división normal de> 50% de los ovocitos (Figura 3). Generalmente entre 30-60% de los ovocitos transferidos sobreviven más allá de las etapas Néurula. Por lo general, la transferencia de ovocitos desde 75 hasta 150 por grupo experimental, que dará embriones suficiente para varios tipos de análisis (in situ, RT-PCR), así como visualizar el fenotipo. La implantación de ovocitos mucho más no parece aumentar considerablemente el rendimiento. Además…

Materials

Solutions and recipes:

OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)

70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine)	(Invitrogen 11415-064)
0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V)	(Sigma A-9418-50g)
1x Penicillin-Streptomycin	(Sigma P-0781)
Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH
Make fresh weekly, store at 18°C.

10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)

1M NaCl

20 mM KCl

20 mM CaCl2

10 mM MgCl2

150 mM HEPES

adjust to pH 7.6-7.8

Store at 4°C

Anesthetic solution

1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222)	(Sigma A-5040)
0.7 g/L sodium bicarbonate
Dissolve in Amquel-treated water
Make fresh weekly

Progesterone stocks

10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol

Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution

Store at -20°C

Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)

Blue: 0.1% Nile Blue A	(Aldrich 121479-5G),
Red: 0.25% Neutral Red	(Sigma N-6634),
Brown: 1% Bismarck Brown	(Sigma B-2759),
Green (80 μl blue + 80 μl brown),
Mauve (80 μl blue + 80 μl red).
A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown.

Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.