Gödsling av Xenopus oocyter Med metoden Host Transfer
Summary
Förfarande för gödsling<em> Xenopus oocyter</em> Av värdlandet överföringsmetod.
Abstract
Studera bidrag maternellt nedärvd molekyler till ryggradsdjur tidiga utvecklingen är ofta hämmas av den tid och kostnad som krävs för att generera mödra-effekt muterade djur. Dessutom har många av de tekniker som överuttrycker eller hämma geners funktion i organismer som Xenopus och zebrafisk inte tillräckligt rikta kritiska moderns signalvägar, som Wnt signalering. I Xenopus kan manipulera geners funktion i odlade ägg och sedan befruktar dem lindra dessa problem till viss del. Oocyter är manuellt defolliculated från givare äggstock vävnad, injiceras eller behandlas i kultur som önskat, och då stimuleras med progesteron att framkalla mognad. Därefter är de oocyter förs in i kroppen hålighet i en ägglossning värd kvinnlig groda, varpå de kommer att bli flyttad till värdens äggledare och skaffa ändringar och gelé rockar som behövs för befruktning. Den resulterande embryona kan sedan höjas till den önskade scenen och analyseras för effekterna av eventuella experimentella störningar. Detta värd-överföringsmetod har varit mycket effektiv i att avslöja grundläggande mekanismer tidig utveckling och möjliggör ett brett spektrum av experimentella möjligheter inte finns i några andra ryggradsdjur modell organism.
Protocol
Discussion
En lyckad överlåtelse kommer att resultera i befruktning och normala klyvning av> 50% av oocyter (Figur 3). Allmänhet mellan 30-60% av de överförda oocyter kommer att överleva förbi neurula steg. Vi överför brukar 75-150 ägg per experimentell grupp, som kommer att ge tillräckligt embryon för flera typer av analyser (in situ, RT-PCR) samt visualisera fenotyp. Implantation betydligt mer oocyter verkar inte kraftigt öka avkastningen. Dessutom bör minst 30 ägg per grupp överföras för att garantera att ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka medlemmarna i Houston lab för kritisk läsning av manuskriptet. Forskningen stöds av National Institutes of Health (GM083999) tilldelas DWH
Materials
Solutions and recipes:
OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)
| 70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine) | (Invitrogen 11415-064) |
| 0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V) | (Sigma A-9418-50g) |
| 1x Penicillin-Streptomycin | (Sigma P-0781) |
| Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH | |
| Make fresh weekly, store at 18°C. | |
10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)
| 1M NaCl |
| 20 mM KCl |
| 20 mM CaCl2 |
| 10 mM MgCl2 |
| 150 mM HEPES |
| adjust to pH 7.6-7.8 |
| Store at 4°C |
Anesthetic solution
| 1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222) | (Sigma A-5040) |
| 0.7 g/L sodium bicarbonate | |
| Dissolve in Amquel-treated water | |
| Make fresh weekly | |
Progesterone stocks
| 10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol |
| Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution |
| Store at -20°C |
Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)
| Blue: 0.1% Nile Blue A | (Aldrich 121479-5G), |
| Red: 0.25% Neutral Red | (Sigma N-6634), |
| Brown: 1% Bismarck Brown | (Sigma B-2759), |
| Green (80 μl blue + 80 μl brown), | |
| Mauve (80 μl blue + 80 μl red). | |
| A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown. | |
Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.
References
- Brun, R. Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis. Experientia. 31, 1275-1276 (1975).
- Elinson, R. P., Pasceri, P. Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos. Development. 106, 511-518 (1989).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro. Development. 100, 735-743 (1987).
- Houston, D. W., King, M. L. A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus. Development. 127, 447-456 (2000).
- Mir, A., Heasman, J. How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique. Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).
- Rugh, R. . Experimental Embryology: Techniques and procedures. , (1962).
- Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles. Dev Biol. 17, 627-643 (1968).
- Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. Oogenesis and oocyte isolation. Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).
- Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos. Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).
- Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. Maternal beta-catenin establishes a ‘dorsal signal’ in early Xenopus embryos. Development. 122, 2987-2996 (1996).
- Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos. Cell. 94, 515-524 (1998).
- Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J., Richter, J. D. Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach.. A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos. , 341-354 (1998).
