التطبيقية ليزر Microdissection التنميط التعبير الجيني للخلايا من المجموعة الثانوية من ذبابة الفاكهة جناح القرص

Summary

تم تطبيق الليزر لتحليل الجينات microdissection التنميط التعبير في مقصورات معينة من القرص جناح ذبابة الفاكهة تتعرض لرني المترجمة

Abstract

وقد ثبت الطبيعة غير المتجانسة للأنسجة ليكون عاملا يحد من كمية المعلومات التي يمكن توليدها من العينات البيولوجية ، وتحليلات المساس المصب. النظر في الجمعيات المعقدة والديناميكية الخلوية الموجودة داخل العديد من الأنسجة ، من أجل أن ألخص في التفاعلات الجزيئية فيفو تحليل دقيق يجب على المرء أن يكون قادرا على تحليل السكان خلية معينة ضمن سياقها الأصلي. ويمكن بوساطة الليزر microdissection تحقيق هذا الهدف ، مما يسمح تحديد لا لبس فيها والحصاد الناجح للخلايا من الفائدة في ظل التصور المجهري المباشر مع المحافظة على سلامة الجزيئية. لقد طبقنا هذه التكنولوجيا لتحليل الجينات داخل مناطق محددة من القرص النامية جناح ذبابة الفاكهة ، وهو ما يمثل نظام نموذجي لدراسة المفيد مراقبة النمو ، وتمايز الخلايا وorganogenesis. وتنقسم precociously أقراص تخيلي اليرقات داخل المقصورات الأمامية والخلفية ، والظهري البطني بواسطة تقييد حدود النسب. الاستفادة من محرض GAL4 - UAS نظام ثنائي التعبير ، ويمكن لكل من هذه المقصورات المسمى تحديدا في الذباب المعدلة وراثيا إبداء التحوير UAS - GFP تحت سيطرة المناسبة GAL4 سائق بناء. في الأقراص المعدلة وراثيا ، ويمكن على وجه التحديد التنميط الجيني التعبير عن مجموعات فرعية منفصلة من الخلايا يتحدد بعد بوساطة الليزر microdissection ، وذلك باستخدام إشارة GFP الفلورسنت لتوجيه الليزر قطع.

من بين مجموعة متنوعة من التطبيقات المصب ، وركزنا على التنميط النص بعد تدخل الحمض النووي الريبي RNA مترجم (رني). مع ظهور التكنولوجيا رني ، يمكن أن يترافق مع وضع العلامات GFP ضربة قاضية المترجمة من جين معين ، مما يسمح للاستجابة الترانسكربتي الحاسم للسكان الخلية المنفصلة إلى إسكات جينات معينة. للتحقق من صحة هذا النهج ، ونحن تشريح المناطق يعادل القرص من الخلفي (المسمى من قبل التعبير GFP) ، والأمامي (لا تحمل علامات) مقصورة على إسكات الإقليمية في المقصورة ف من الجينات على خلاف ذلك أعرب بتواجد مطلق تم استخراج الحمض النووي الريبي من microdissected المناطق أسكت وunsilenced والمقارنة التنميط التعبير الجيني التي تحددها الكمية في الوقت الحقيقي RT - PCR. يمكن أن نظهر هذه الطريقة فعالة لتطبيقها transcriptomics دقيقة من مجموعات فرعية من الخلايا داخل أقراص تخيلي ذبابة الفاكهة. في الواقع ، في حين ضخمة إعداد القرص كمصدر من الحمض النووي الريبي يفترض عموما التجانس الخلية ، فمن المعروف جيدا أن التعبير يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا الترانسكربتي داخل هذه الهياكل في ذلك المعلومات الموضعية. باستخدام مترجم إشارة GFP الفلورسنت لتوجيه الليزر قطع ، يمكن إجراء تحليلات أكثر دقة والترانسكربتي تطبيق مربح لتطبيقات متباينة ، بما في ذلك التنميط نص الأنساب خلية مستقلة ضمن سياقها الأصلي.

Protocol

الجزء 1. إعداد أقراص جناح ذبابة الفاكهة خضعت لتخيلي رني محددة والمترجمة.

والمواد البيولوجية ، استخدمنا أقراص الجناح تخيلي ذبابة الفاكهة التي تم الحصول عليها من يرقات وراثيا تخضع لإسكات جينات معينة والمترجمة عن طريق نظام GAL4/UAS ^1. هذا النسل اليرقات orginates من كرة عرضية الوراثية التي تنطوي على خطين الوالدين : واحد يحمل السائق GAL4 ، والثانية في الرد UAS. بالإضافة إلى التعبير عن GAL4 في نمط زمنية محددة و / أو المكاني ، والخط سائق يحمل مراسل UAS - GFP التي تسمح لتصور المجال GAL4 التعبير. سطر المستجيب UAS يعرب تحت سيطرة تسلسل UAS ، وهو منعطف حاد إسكات الحمض النووي الريبي (hpRNA) قادرة على استهداف الجين على وجه التحديد مختارة من الفائدة (الذي يطلق عليه جين X) ^2. وأعرب مرة واحدة في الخلية ، هو المشقوق العاشر hpRNA لتوليد الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا) قادرا على الصمت تحديدا الجين المحدد. في ذرية اليرقات ، التي تحمل كلا من السائق والمستجيب الجينات المحورة ، يتم نسخها فقط بناء UAS - إسكات تلك الخلايا في التعبير عن بروتين GAL4 ، وبالتالي فهي قادرة على إحداث إسكات مقيدة مكانيا من تحديد الجين X.

من بين مجموعة متنوعة من التطبيقات الممكنة ، طبقنا هذا النهج لإسكات الجين مختارة من مصلحتنا (الجينات X) تحت سيطرة GAL4 - engrailed (عربي) سائق ، والتي يمكن أن تؤدي إلى إسكات محددة في المقصورة الخلفية من القرص الجناح ³ ، تميزت الأراضي التي كتبها للتعبير عن التحوير UAS - GFP.

كانت تصمت أقراص الجناح تخيلي تشريح اليد ، مع الحرص على إزالة الأنسجة المحيطة الملوثة ، ولا سيما الالتزام القصبات. ثم كان كل قرص الجناح معزولة بسرعة وبلطف نقلها إلى الإطار سبق علاجها ريبونوكلياز ، تشريح مجانية ليزر microdissection الفوري لمناطق مختارة.

الجزء 2. microdissection ليزر من مناطق مختارة من المقصورات (الأمامية) أسكت (الخلفي) وunsilenced من القرص الجناح.

كان يوما القرص الجناح على الغشاء ، microdissection الليزر من المجالات المحددة من إسكات (الخلفي ؛ GFP المسمى) وunsilenced (الأمامي ؛ GFP - لا تحمل علامات) وقد تحقق المقصورات. تم تنفيذ ذلك من خلال رسم المنطقة التي يمكن أن تناسب بسهولة في كلا ، ان الجانبين GFP الإيجابية والسلبية GFP من القرص. تحت microdissector ، ركزنا أولا شعاع الليزر على النسيج GFP إيجابية ، مما يجعل من خفض طول محيط المحدد. عائدات microdissector مع خفض في سرعة تحديد والسلطة ، ولكن من الممكن لصقل القطع يدويا ، وحتى منطقة مختارة من الأنسجة يقع في أنبوب تحت. هذا الأنبوب يحتوي على كمية صغيرة من الكاشف TRI ، بحيث النسيج GFP إيجابية على استعداد لاستخراج الحمض النووي الريبي لاحقة.

انتقلنا بعد ذلك إلى منطقة القطع على العكس ، GFP - الجانبية السلبية للقرص الجناح ، من أجل تشريح أرض ما يعادلها من النسيج unsilenced GFP سلبية. مرة أخرى ، بعد أن قطع التلقائي ، مضينا في صقل قطع يدويا. مرة واحدة وقد تم خفض ، كما تم العثور على الأنسجة GFP سلبية في الكاشف TRI ، وعلى استعداد لاستخراج الحمض النووي الريبي.

الجزء 3. RNA استخراج والتنميط النسخ من المناطق Microdissected الأنسجة.

نحن نسج أنابيب لفصل السوائل من قبعة وأضاف الكاشف TRI يصل إلى 1 مل ثم اجرى استخراج الحمض النووي الريبي بعد بروتوكول الكاشف TRI القياسية. لجمع ما يكفي من المواد ، كررنا هذا الإجراء على 100 قطع أقراص الجناح تخيلي. بدءا من 100 منطقة من حوالي ² لكل 5000 ميكرون ، وكان العائد لدينا من 1.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي. ثم كانت تسيطر دقة التشريح دليل التعبير عن طريق فحص عينات GFP في إسكات وunsilenced بواسطة RT - PCR ، وذلك باستخدام سوبر السيناريو الثالث (Invitrogen) لتجميع [كدنا] مع Hexamers عشوائية. وأجريت التحاليل الكمية لاحقة تركز على تحديد مستويات التعبير الجيني للX إسكاته ، جنبا إلى جنب مع تلك الأهداف المفترضة لمسار التنظيمي ، وذلك في الوقت الحقيقي باستخدام RT - PCR ماجستير ميكس (Invitrogen).

Discussion

فيما يتعلق مستوياتها التعبير القاعدية التي تحققت في المقصورات الأمامية / الخلفية من أقراص الجناح unsilenced ، تم العثور على نشاط الجين المحدد X خفضت الى 40 ٪ عند إسكات. في المقابل ، تم العثور على واحد من أهدافها المفترضة (الجينات Y) بشكل ملحوظ التنظيم (7 أضعاف الزيادة) ، مما يؤدي بنا للتحقق من صحة الفرضية التي تم تنظيمها من قبل سلبا عاشرا الجين

يمكن أن نستنتج أن هذا النهج بنجاح المذكورة أعلاه تجريبية يتم تطبيقها على التحقق من الأهداف المفترضة للمسارات تنظيمية متنوعة.

بالإضافة إلى ذلك ، فإننا نخلص إلى أن التحسن في العائد لاستخراج الحمض النووي الريبي قد تسمح بسرعة توصيف التنميط النسخ المترجمة عن طريق التحليل ميكروأري. وهذا الباب مفتوحا أمام إمكانية لتحقيق مزيد من النظرة التفصيلية العمليات البيولوجية الهامة. للحصول على أمثلة ، يمكن تشكيل المترجمة من التدرجات تخلقية ^{4 أو 5} أو التبديل الترانسكربتي يشدد على عملية المنافسة الخلية ⁶ ، حيث يفقد استنساخ الخلية ويمكن تصور الفائز من قبل التعبير GFP التفاضلية ، ويمكن أن يكون أكثر تحديدا معالجتها. بغض النظر عن التطبيق ، ويمكن لهذا النهج أن يساعد في تحديد ردود أفعال الترانسكربتي الأراضي الخلوية المختلفة في سياقها الأصلي الأنسجة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC water	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI Reagent	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
Master Mix	Invitrogen	11761100
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9516
Chloroform	Sigma-Aldrich	C7559
Dream taq	Fermentas	EP0701
Fly strains Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).