Microdisección láser aplicada a perfiles de expresión génica de subconjunto de las células de la Drosophila Ala Disco

Summary

Microdisección láser se aplicó para analizar perfiles de expresión génica en compartimentos específicos de Drosophila disco ala sometida a localizado RNAi

Abstract

Naturaleza heterogénea de los tejidos ha demostrado ser un factor limitante en la cantidad de información que puede ser generada a partir de muestras biológicas, lo que compromete los análisis. Teniendo en cuenta las asociaciones celulares complejos y dinámicos que existen en muchos tejidos, con el fin de recapitular las interacciones in vivo el análisis molecular a fondo uno debe ser capaz de analizar poblaciones específicas de células dentro de su contexto de origen. Laser mediada por microdisección puede lograr este objetivo, lo que permite identificar de forma inequívoca y exitosa cosecha de las células de interés bajo visualización microscópica directa, manteniendo la integridad molecular. Hemos aplicado esta tecnología para analizar la expresión de genes dentro de áreas definidas del desarrollo del disco ala de Drosophila, lo que representa un modelo de sistema ventajoso para estudiar el control del crecimiento, la diferenciación celular y la organogénesis. Larval discos imaginales se subdivide en compartimentos precozmente anterior y posterior, dorsal y ventral de los límites de restricción de linaje. Haciendo uso de la inducible GAL4-UAS sistema de expresión binaria, cada uno de estos compartimentos pueden ser etiquetados específicamente en las moscas transgénicas que expresan un transgén UAS-GFP bajo el control de la adecuada GAL4 conductor de construcción. En los discos de transgénicos, perfiles de expresión génica de los subconjuntos de células discretas precisamente puede determinarse después de láser mediada por microdisección, utilizando la señal de GFP fluorescentes para guía de corte por láser.

Entre la variedad de aplicaciones posteriores, nos centramos en perfiles de transcripción del ARN después de localizada la interferencia de ARN (RNAi). Con el advenimiento de la tecnología del RNAi, las buenas prácticas agrarias de etiquetado puede ir acompañado de caída localizada de un gen determinado, lo que permite determinar la respuesta transcripcional de una población de células discretas para el silenciamiento de genes específicos. Para validar este enfoque, hemos diseccionado áreas equivalentes del disco desde la parte posterior (marcado por la expresión de GFP), y la anterior (sin etiqueta) en compartimiento de silenciar regional en el compartimiento de P de un gen de otro modo de expresión ubicua. Se extrajo el ARN de microdissected áreas silenciadas y sin silenciador y el perfil comparativo de la expresión de genes determinados por cuantitativa en tiempo real RT-PCR. Se demuestra que este método se puede aplicar con eficacia para la transcriptómica precisa de los subconjuntos de células dentro de los discos imaginales de Drosophila. En efecto, mientras que la preparación del disco masiva como fuente de ARN en general, supone homogeneidad de la célula, es bien sabido que la expresión de la transcripción puede variar mucho dentro de estas estructuras como consecuencia de la información de posición. Utilizando la señal fluorescente GFP localizada a guía de corte por láser, los análisis de la transcripción más precisa se puede realizar y rentable aplicado a diferentes aplicaciones, incluyendo perfiles de transcripción de los distintos linajes de células dentro de su contexto de origen.

Protocol

Parte 1. Preparación de los discos imaginal del ala de Drosophila Sometido a RNAi específico y localizado.

Como material biológico, que utiliza discos imaginal del ala de Drosophila obtenida a partir de larvas transgénicas sometidas a la silenciamiento de los genes localizados y específicos por medio del sistema de GAL4/UAS ^1. Esta progenie larval orginates de un cruce genético asociado con las dos líneas parentales: uno que lleva el conductor GAL4, la segunda la respuesta UAS. Además de expresar GAL4 en el patrón de un temporal específica y / o espaciales, la línea conductor lleva un reportero UAS-GFP que permite visualizar el dominio de la expresión GAL4. La línea de UAS de respuesta expresa, bajo el control de la secuencia UAS, una horquilla de silenciamiento del ARN (hpRNA) capaces de dirigirse específicamente a los genes seleccionados por su interés (lo llaman gen X) ^2. Una vez que se expresa en la célula, el X hpRNA se escinde para generar pequeños ARN de interferencia (siRNA) capaz de silenciar específicamente el gen seleccionado. En la descendencia de larvas, que lleva el conductor y los transgenes de respuesta, es sólo la construcción UAS-silenciar transcripción en las células que expresan la proteína GAL4, y por lo tanto es capaz de inducir un silenciamiento restricción espacial de los genes seleccionados X.

Entre la variedad de posibles aplicaciones, se ha aplicado este método para silenciar un gen seleccionado de nuestro interés (gen X) bajo el control de la engrailed-GAL4 (es) del conductor, que puede provocar el silenciamiento específico en el compartimento posterior del disco de ala ³ , cuyo territorio se caracterizó por la expresión del transgén UAS-GFP.

Los discos fueron silenciados imaginal de ala mano disecada, teniendo cuidado de eliminar la contaminación de los tejidos circundantes, especialmente en la tráquea adheridos. Cada disco ala aislada fue entonces rápidamente y se transfieren cuidadosamente a un tratamiento previo, el marco disección de RNasa libre de microdisección láser inmediata de las áreas seleccionadas.

Parte 2. Microdisección con láser de las áreas seleccionadas de los silenciados (posterior) y sin silenciador (anterior) compartimentos del disco del ala.

Una vez que el disco estaba en el ala de la membrana, microdisección láser de las áreas específicas de silencio (posterior; GFP-etiquetado) y sin silenciador (anterior, GFP-etiquetados) compartimentos se logró. Este dibujo fue realizado por un área que podría encajar fácilmente en tanto, los lados positivos y las buenas prácticas agrarias-GFP-negativos del disco. Bajo el Microdisector, lo primero que se centró el rayo láser en el tejido GFP-positivas, haciendo un corte a lo largo del perímetro seleccionado. El producto Microdisector con corte a la velocidad seleccionada y el poder, pero es posible perfeccionar el corte de forma manual, hasta que el área seleccionada del tejido cae en el tubo por debajo. Este tubo contiene una pequeña cantidad del reactivo TRI, por lo que el tejido GFP-positivo está listo para la posterior extracción de RNA.

Estamos posteriormente se trasladó al área de corte de lo contrario, GFP-negativos lado del disco de ala, con el fin de diseccionar un territorio equivalente a la sin silenciador, GFP-negativos tejidos. Una vez más, después de que el corte automático, se procedió a refinar el corte manual. Una vez que el corte se llevó a cabo, también el tejido GFP-negativos se recuperó en el reactivo TRI, listo para la extracción de RNA.

Parte 3. La extracción de RNA y perfiles de transcripción de las áreas de tejido microdissected.

Giramos los tubos para separar el líquido de la tapa y añade reactivo TRI hasta 1 ml, y luego realizaron la extracción de ARN, siguiendo el protocolo reactivo TRI estándar. Para recoger el material suficiente, se repitió el procedimiento de corte de 100 discos imaginal del ala. A partir de 100 zonas de alrededor de 5.000 m ² cada uno, nuestro rendimiento fue de 1,5 g de ARN. Exactitud de la disección manual fue controlada entonces por comprobar la expresión de GFP en las muestras de silencio y sin silenciador por RT-PCR, usando Super Guión III (Invitrogen) para sintetizar el cDNA con hexámeros aleatorios. Posterior análisis cuantitativo se centró en determinar los niveles de expresión de los genes silenciados X, junto con los de supuestos objetivos de su vía de reglamentación, se llevaron a cabo por Real Time RT-PCR utilizando Master Mix (Invitrogen).

Discussion

Con respecto a sus niveles de expresión basal logrado en los compartimentos anterior / posterior de los discos del ala sin silenciador, la actividad del gen X seleccionados se encuentran reducidos al 40% en silencio. Por el contrario, uno de sus supuestos objetivos (genes Y) se encontró significativamente hasta reguladas (7 veces de aumento), que nos lleva a validar la hipótesis de que fue regulada negativamente por el gen X.

Llegamos a la conclusión de que el enfoque descrito anteriormente experimental puede aplicarse con éxito a la validación de los supuestos objetivos de las diversas vías de reglamentación.

Además, suponemos que la mejora en el rendimiento de la extracción de RNA rápidamente podría permitir la caracterización de los perfiles de transcripción localizados mediante el análisis de microarrays. Esto abrirá la posibilidad de lograr una visión más detallada de los procesos biológicos. Por ejemplo, la formación localizada de los gradientes morfogenéticos ^{4, 5} o el interruptor de la transcripción que subraya el proceso de competencia de ⁶ celdas, que perder y los clones de células ganador puede ser visualizado por la expresión diferencial de las buenas prácticas agrarias, podría ser más específicamente. Sea cual sea la aplicación, este enfoque puede ayudar a definir la respuesta transcripcional de los diferentes territorios celulares en el contexto de tejido nativo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC water	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI Reagent	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
Master Mix	Invitrogen	11761100
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9516
Chloroform	Sigma-Aldrich	C7559
Dream taq	Fermentas	EP0701
Fly strains Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).