Laser Microdissection Tillämpat på Gene Expression Profilering av delmängd av celler från Drosophila Wing skiva

Summary

Laser microdissection har tillämpats för att analysera profilering av genuttryck i specifika fack Drosophila vingen skiva utsätts för lokaliserad RNAi

Abstract

Heterogena karaktär vävnader har visat sig vara en begränsande faktor i den mängd information som kan genereras från biologiska prover, kompromissa nedströms analyser. Med tanke på den komplexa och dynamiska cellulära föreningar finns inom många vävnader, för att sammanfatta in vivo interaktioner grundliga molekylär analys ett måste kunna analysera specifika cellpopulationer i sitt eget sammanhang. Laser-medierad microdissection kan uppnå detta mål, så otvetydig identifiering och framgångsrik skörd av celler av intresse i direkt mikroskopiska visualisering bibehållen molekylär integritet. Vi har tillämpat denna teknik för att analysera genuttryck inom definierade områden i utvecklingsländer Drosophila vingen skiva, vilket motsvarar ett fördelaktigt modellsystem för att studera tillväxt kontroll, celldifferentiering och organogenesen. Larver imaginal skivor är precociously indelas i främre och bakre, rygg-och ventral fack med gränser härstamning begränsning. Att använda sig av den inducerbara GAL4-UAS binära uttryck systemet, var och en av dessa avdelningar kan speciellt märkas transgena flugor som uttrycker en UAS-GFP transgenen under kontroll av lämplig GAL4-driver konstruktion. I transgena skivor kan profilering av genuttryck för diskreta undergrupper av celler exakt bestäms efter laser-medierad microdissection, med hjälp av fluorescerande GFP signalen att vägleda laserskurna.

Bland de många olika tillämpningar i efterföljande led har vi fokuserat på RNA avskrift profilering efter lokaliserade RNA-interferens (RNAi). Med tillkomsten av RNAi-teknik kan GFP märkning kopplas med lokaliserade ÖVERVÄLDIGANDE av en viss gen, så att bestämda i transkriptionell svar på en diskret cellpopulation till den specifika geners uttryck. För att validera denna metod, dissekerade vi motsvarande områden av skivan från den bakre (märkt av GFP uttryck), och den främre (omärkta) facket på regionala tysta i P-facket i en annars ubiquitously uttryckt gen. RNA var ur microdissected tystas och unsilenced områden och jämförande profilering av genuttryck bestäms av kvantitativ realtids-RT-PCR. Vi visar att denna metod på ett effektivt sätt kan användas för noggranna transkriptomik av delmängder av celler i Drosophila imaginal skivor. I själva verket, medan massiva skiva förberedelser som källa av RNA allmänhet förutsätter cell homogenitet är det väl känt att transkriptionell uttryck kan variera kraftigt inom dessa strukturer till följd av positionsinformation. Använda lokaliserad fluorescerande GFP-signal för att styra laserskurna, kan mer exakt transkriptionell analyser göras och lönsamt tillämpas för olika tillämpningar, inklusive utskrift profilering av olika cell linjer inom sitt eget sammanhang.

Protocol

Del 1. Beredning av Drosophila Imaginal Wing skivor på särskilda och lokal RNAi.

Som biologiskt material har vi använt Drosophila imaginal vinge skivor från transgena larver utsättas för lokala och specifika geners uttryck med hjälp av GAL4/UAS systemet ^1. Detta larver avkomma orginates från en genetisk kors med två föräldrar linjer: en som bär GAL4 föraren, den andra yrkeshögskolan responder. Förutom att uttrycka GAL4 i en specifik tid och / eller rumsliga mönster, bär föraren linjen ett UAS-GFP reporter som gör att visualisera GAL4 uttrycket domän. Yrkeshögskolan responder linje uttrycker, under kontroll av yrkeshögskolan sekvens, en hårnål RNA-interferens (hpRNA) kan specifikt rikta den valda genen av intresse (kalla det gen X) ^2. När uttrycks i cellen, är hpRNA X klyvs att generera små störande RNA (siRNA) kan specifikt tysta den valda genen. I larver avkomma, bär att både förare och responder transgener, yrkeshögskolan-ljuddämpning konstruera endast skrivas i dessa celler uttrycker GAL4 proteinet, och därmed kan ge upphov till en rumsligt begränsad tysta den valda genen X.

Bland de många möjliga tillämpningar tillämpade vi denna metod för att tysta en vald gen av vårt intresse (genen X) under kontroll av de engrailed-GAL4 (sv) förare, som kan utlösa specifika tysta i den bakre facket av vingen Disc ³ var vars territorium präglades av uttrycket av UAS-GFP transgen.

Den tystade imaginal vingen skivor har hand dissekeras, var noga med att eliminera omgivande förorenar vävnader, särskilt vidhängande tracheas. Varje isolerad vinge skivan var sedan snabbt och försiktigt över till ett tidigare behandlat, RNas gratis dissektion ram för omedelbar laser microdissection utvalda områden.

Del 2. Laser microdissection av valda områden från de tystade (bakre) och unsilenced (främre) fack av vingen skivan.

När vingen skivan var på membranet, laser microdissection av specifika områden från tystnar (bakre, GFP-märkta) unsilenced och (främre, GFP-omärkta) fack uppnåddes. Detta utfördes genom att dra ett område som lätt skulle kunna passa i båda, GFP-positiva och GFP-negativa sidor av skivan. Enligt microdissector fokuserade vi först laserstrålen på GFP-positiva vävnad, vilket gör ett snitt längs den valda omkrets. Den microdissector fortsätter med skärande på vald hastighet och kraft, men det är möjligt att förfina skär manuellt, tills den valda området vävnad faller i röret under. Detta röret innehåller en liten volym TRI Reagens, så att GFP-positiva vävnad är redo för kommande RNA-extraktion.

Vi flyttade därefter skärområdet till det motsatta, GFP-negativa sidan av vingen skivan, för att dissekera en likvärdig territorium från unsilenced, GFP-negativa vävnad. Återigen efter frånkopplingsautomatiken, fortsatte vi att förfina snittet manuellt. När snittet var gjort, även GFP-negativa vävnad återfanns i TRI Reagens, redo för RNA-extraktion.

Del 3. RNA-extraktion och transkription profilering från Microdissected Tissue områden.

Vi snurrade rören bort vätskan från mössan och lagt TRI Reagens till 1 ml, sedan utförs RNA-extraktion enligt standarden TRI Reagens protokollet. Att samla in tillräckligt med material, upprepade vi skär proceduren på 100 imaginal vinge skivor. Från 100 områden med ca 5000 ìm ² vardera, var vår avkastning på 1,5 mikrogram av RNA. Noggrannhet av handboken dissekering sedan kontrolleras genom att kontrollera GFP uttryck i tystade och unsilenced prover genom RT-PCR, med hjälp av Super Script III (Invitrogen) att syntetisera cDNA med Random hexamerer. Efterföljande kvantitativa analyser fokuserade för att bestämma uttrycket nivåer tystade genen X, tillsammans med de förmodade mål av dess reglerande väg, utfördes av Real Time RT-PCR med hjälp av Master Mix (Invitrogen).

Discussion

Med avseende på deras basala uttryck nivåer som uppnåddes i den främre / bakre fack unsilenced vinge skivor, var aktiviteten på den valda genen x hittade sänkas till 40% på ljuddämpning. Däremot var en av dess förmodade mål (gener Y) fann signifikant upp-reglerade (7 faldig-ökning), leder oss att bekräfta hypotesen att det negativt regleras av genen X.

Vi drar slutsatsen att de ovan beskrivna experimentella metoden framgångsrikt kan tillämpas på validering av förmodade mål av olika regelverk vägar.

Dessutom förmodar vi att förbättra utbytet av RNA-extraktion snabbt kan tillåta karakterisering av lokaliserade transkription profilering av microarray analys. Detta kommer att öppna möjligheten att få en mer detaljerad bild av viktiga biologiska processer. För exempel kan lokaliserade bildandet av morfogenetiska gradienter ^{4, 5} eller transkriptionella växla understryker processen för cell tävling ^6, där förlora och vinnare kloner cellen visualiseras genom differential GFP uttryck, kunde vara mer specifikt behandlas. Oavsett tillämpning, kan denna metod bidra till att definiera transkriptionell respons av olika cellulära områden i sitt ursprungliga vävnaden sammanhang.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC water	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI Reagent	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
Master Mix	Invitrogen	11761100
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9516
Chloroform	Sigma-Aldrich	C7559
Dream taq	Fermentas	EP0701
Fly strains Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).