Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Summary

Lazer mikrodiseksiyon Drosophila kanat diskin belirli bölümlerinde lokalize RNAi tabi gen ekspresyonu analiz etmek için uygulanan

Abstract

Dokuların heterojen doğası, mansap analizleri ödün, biyolojik örnekler üretilen bilgi miktarı kısıtlayıcı bir faktör olduğu kanıtlanmıştır. In vivo etkileşimleri kapsamlı moleküler analiz özetlemek için, birçok dokuda içinde varolan karmaşık ve dinamik hücresel dernekler göz önüne alındığında biri kendi ana kapsamında özel hücre popülasyonlarının analiz etmek gerekir. Lazer-aracılı mikrodiseksiyon moleküler bütünlüğünü korurken ilgi hücreleri doğrudan mikroskobik görüntü altında açık kimliği ve başarılı bir hasat sağlayarak, bu hedefe ulaşabilirsiniz. Biz, büyüme kontrolü, hücre farklılaşması ve organogenez çalışma için avantajlı bir model sistemi temsil eden gelişmekte olan Drosophila kanat disk, tanımlı alanlar içinde gen ekspresyonu analiz etmek için bu teknolojiyi uyguladık. Larvaların hayali diskler precociously soy kısıtlama sınırları anterior ve posterior, dorsal ve ventral bölmelere ayrılmıştır. Indüklenebilir GAL4 UAS ikili ifade sistemi, bu bölmelerin her biri özel olarak inşa GAL4 uygun sürücünün kontrolü altında bir UAS-GFP transgen ifade transgenik sinekler etiketli olabilir kullanılması. Transgenik diskler, ayrık altkümelerini hücreleri gen ekspresyon profili tam olarak, lazer kesim kılavuzu floresan GFP sinyali kullanılarak, lazer aracılı mikrodiseksiyon sonra tespit edilebilir.

Çeşitli aşağı uygulamaları arasında, lokalize RNA enterferans (RNAi) sonra RNA transkript profil üzerinde duruldu. GFP etiketleme, RNAi teknolojisi gelişiyle birlikte, belirli bir gen susturulması için ayrı bir hücre popülasyonu transkripsiyonel yanıt tespitine izin verilen bir genin lokalize demonte ile birleştiğinde olabilir. Bu yaklaşımı doğrulamak için, diskin posterior (GFP ifade etiketli) eşdeğer alanlar diseke ve bir başka yerde eksprese gen P bölmesi bölgesel susturulması üzerine anterior (etiketsiz) bölmesi. RNA microdissected susturulması ve unsilenced alanları ve kantitatif gerçek zamanlı RT-PCR tarafından belirlenen karşılaştırmalı gen ekspresyon profili çıkarılmıştır. Biz bu yöntem etkili Drosophila hayali diskler içinde hücreler altkümelerini doğru transkriptomik için uygulanabilir olduğunu göstermektedir. RNA kaynağı olarak büyük disk hazırlığı genellikle hücre homojenlik varsayar Nitekim, iyi transkripsiyonel ifade pozisyon bilgisi sonucunda bu yapıların içinde büyük ölçüde değişebilir bilinir. Lazer kesim kılavuzu lokalize floresan GFP sinyalini kullanarak, daha doğru transkripsiyonel analizleri yapılır ve kârlı onların yerli kapsamında farklı hücre soylarının transkript profil de dahil olmak üzere farklı uygulamaları, uygulanabilir.

Protocol

Bölüm 1. Özgül ve Lokalize RNAi Maruz Drosophila hayali Kanat Diskler hazırlanması.

Biyolojik madde olarak, elde edilen transgenik larvaları GAL4/UAS sistemi ¹ yerelleştirilmiş ve özel gen susturulması tabi Drosophila hayali kanat diskler kullanılır. GAL4 sürücü, ikinci UAS cevaplayıcı taşıyan: Bu larva döl iki ebeveyn hatları içeren bir genetik çapraz orginates. Belirli bir zamansal ve / veya uzaysal desen GAL4 ifade etmek için ek olarak, sürücü hattı GAL4 ifade etki alanı görüntülemenizi sağlar UAS-GFP muhabiri taşır. UAS cevaplayıcı hattı, UAS sırası kontrolü altında bir saç tokası, susturma özellikle ilgi seçilen gen (çağrı geni X) ² hedef RNA (hpRNA) ifade eder. Hücrede ifade hpRNA X oluşturmak için özel olarak seçilen gen susturmak için küçük bir müdahale RNA (siRNA) bölünmüş. Larva döl, sürücü ve UAS susturulması inşa GAL4 protein ifade bu hücrelerin sadece transkripsiyonu cevaplayıcı transgenlerin taşır ve böylece, seçilen gen X mekansal sınırlı susturulması uyarabildiklerini

Çeşitli olası uygulamalar arasında, engrailed-GAL4 kontrolü altında bizim ilgi seçilen bir gen (gen X) (tr) sürücüsü, kanat disk ³ posterior kompartman belirli susturulması tetikleyebilir susturmak için uygulanan bu yaklaşım , topraklarından UAS-GFP transgen ifadesi damgasını vurdu.

Susturuldu hayali kanat diskler, el disseke özellikle çevre kirlenmesine neden olan dokular, yapıştırma tracheas ortadan kaldırmak için özen. Her izole kanat disk sonra hızlı bir şekilde ve yavaşça seçilen alanların hemen lazer mikrodiseksiyon için önceden tedavi, RNaz ücretsiz diseksiyonu çerçeve nakledildi.

Bölüm 2. Lazer mikrodiseksiyon kanat disk susturuldu (posterior) ve (ön) unsilenced bölmeleri seçilmiş alanlarda.

Unsilenced (anterior; GFP-etiketlenmemiş) bölmeleri elde edildi; sonra kanat disk susturuldu (GFP etiketli arka) belirli alanlarda lazer mikrodiseksiyon, membran üzerinde oldu. Bu bir alana çekerek, hem de kolayca sığabilir yapıldı, disk GFP pozitif ve GFP-negatif tarafları. Microdissector altında, ilk seçilen çevresince bir kesim, lazer ışını GFP pozitif doku üzerinde duruldu. Microdissector seçilen hız ve güç kesme ile devam eder, ancak doku seçilen alanın altındaki tüp düşene kadar, elle kesim rafine için mümkündür. Bu tüp GFP pozitif doku sonraki RNA ekstraksiyonu için hazır olması, TRI Reaktif küçük bir hacim içerir.

Biz sonradan unsilenced, GFP-negatif doku eşdeğer bir bölgeyi incelemek amacıyla, GFP-olumsuz yan kanat disk, tam tersi kesim alana taşındı. Bir kez daha, sonra otomatik kesme, el kesme rafine başladı. Sonra RNA ekstraksiyonu için hazır kesilmiş, GFP-negatif doku TRI Reaktif kurtarıldı, yapıldı.

Bölüm 3. Microdissected Doku Alanları RNA Ekstraksiyon ve Transkripsiyon Profilleme.

Biz kap sıvı ayırmak için tüpler döndü ve daha sonra standart TRI Reaktif protokolü takip RNA ekstraksiyonu, 1 ml TRI Reaktif eklendi. Yeterince malzeme toplamak için, 100 hayali kanat diskler üzerinde kesme işlemi tekrarlanır. Yaklaşık 5000 mikron ² adet 100 bölgelerden başlayarak, verim RNA 1.5 mikrogram oldu. Rastgele hekzamer ile cDNA sentez Super Senaryo III (Invitrogen) kullanarak, manuel diseksiyon Doğruluk sonra RT-PCR ile susturuldu ve unsilenced örnekleri GFP ifade kontrol tarafından kontrol edildi. Master Mix (Invitrogen) kullanarak Gerçek zamanlı RT-PCR ile düzenleyici yolun varsayılan hedefleri ile birlikte, susturuldu gen X ifade düzeylerini belirlemek için odaklanmış sonraki kantitatif analizleri yapıldı.

Discussion

Unsilenced kanat disklerin ön / arka bölümlerinde elde bazal ekspresyon düzeyleri ile ilgili olarak, seçilen gen X faaliyet susturulması üzerine% 40 düşürüldü bulundu. Bunun aksine, olası hedefler (genler Y) biri bizi olumsuz X geni tarafından düzenlenir olduğu hipotezi doğrulamak için önde gelen (7 kat artış) up-regüle önemli ölçüde bulundu

Biz, yukarıda açıklanan deneysel yaklaşım, çeşitli yasal yollar varsayılan hedeflerinin doğrulama başarıyla uygulanabilir olduğu sonucuna varıldı.

Buna ek olarak, RNA ekstraksiyon verimi iyileşme hızla lokalize transkripsiyon profili mikroarray analizi ile karakterizasyonu olanak verebilecek olduğunu düşünüyoruz. Bu olasılığı önemli biyolojik süreçlerin daha ayrıntılı bir görünümünü elde etmek için açılacaktır. Örnekler için, kaybetme ve kazanan hücre klonlarının morfogenetik gradyanlar ^{4, 5} ya da ⁶ hücreli rekabet sürecini vurgulayan transkripsiyonel anahtarı, yerelleştirilmiş oluşumu, daha spesifik olarak ele alınabilir, diferansiyel GFP ifade tarafından görüntülendi olabilir . Uygulama ne olursa olsun, bu yaklaşım, kendi doğal dokusu bağlamında farklı hücresel topraklarının transkripsiyonel yanıt tanımlamak için yardımcı olabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC water	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI Reagent	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
Master Mix	Invitrogen	11761100
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9516
Chloroform	Sigma-Aldrich	C7559
Dream taq	Fermentas	EP0701
Fly strains Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).