레이저 Microdissection는 세포의 하위 집합 유전자 발현 프로 파일링에 적용 Drosophila 윙 디스크

Summary

레이저 microdissection은 현지화된 RNAi를 받게 Drosophila 날개 디스크의 특정 구획에있는 유전자 발현 프로 파일링을 분석에 적용되었다

Abstract

조직의 이질적인 성격 스트림 분석을 손상, 생물 학적 샘플에서 생성된 수있는 정보의 양을에 제한 요소로 입증되었습니다. 생체내 상호 작용의 분자 철저한 분석을 요점을 되풀이하기 위해 많은 조직 내의 기존의 복잡하고 역동적인 세포 연결을 고려 하나는 자신의 기본 컨텍스트 내에서 특정 세포 인구를 분석할 수 있어야합니다. 레이저 중재의 microdissection은 분자 무결성을 유지하면서 직접 미세한 시각에 따라 관심의 세포의 모호하지 식별 및 풍작을 수 있도록,이 목표를 달성하실 수 있습니다. 우리는 성장 조절, 세포 분화 및 organogenesis를 연구하는 유리한 모델 시스템을 대표하는 개발 Drosophila 날개 디스크의 정의된 영역 내에서 유전자 발현을 분석하는이 기술을 적용했습니다. 애벌레 imaginal 디스크는 천재적으로 가계 제한 경계에 의해 앞쪽에 및 사후, 지느러미 및 복부 구획으로 세분화됩니다. inducible GAL4 - UAS 이진 표현 시스템이 구획의 각 특별히 만들 GAL4 - 드라이버 해당의 통제하에 UAS - GFP transgene을 표현 형질 전환 파리에서 라벨 수있는 사용하고. 형질 디스크에서 세포의 개별 하위 집합의 유전자 발현 프로 파일링은 정확하게 레이저 절단을 안내하기 위해 형광 GFP 신호를 사용하여 레이저 중재 microdissection 후 결정하실 수 있습니다.

하류 응용 프로그램의 다양한 가운데, 우리는 지역화된 RNA 간섭 (RNAi) 이후 RNA의 성적표 프로 파일링에 집중했다. RNAi 기술의 출현과 함께, GFP 라벨은 특정 유전자 입을 수있는 분리된 세포 인구의 transcriptional 응답을 한정된 수 있도록, 주어진 유전자의 현지 최저와 결합 수 있습니다. 이 방법의 유효성을 검사하기 위해, 우리는 (GFP 표현으로 표시) 뒷부분에서 디스크의 동일한 영역을 해부하고, 그렇지 않으면 ubiquitously 표현 유전자의 P의 구획에 지역 입을시 앞쪽에 (unlabelled) 구획. RNA는 microdissected 침묵과 unsilenced 영역과 정량 실시간 RT - PCR에 의해 결정 비교 유전자 발현 프로 파일링에서 추출한했다. 우리는이 방법이 효과적으로 Drosophila imaginal 디스크 내에서 세포의 하위 집합의 정확한 transcriptomics에 대해 적용할 수 것을 보여줍니다. RNA의 소스로 거대한 디스크 준비가 일반적으로 세포 균질성을지지하면서 실제로, 그것은 잘 transcriptional 표현이 위치 정보의 결과에서 이러한 구조 내에서 크게 달라질 수 있다고 알려져 있습니다. 레이저 절단을 안내화된 형광 GFP 신호를 사용하여보다 정확한 transcriptional 분석이 수행하고 수익성 자신의 기본 컨텍스트 내에서 서로 다른 세포 lineages의 사본 프로 파일링 포함하여 서로 다른 응용 프로그램에 적용할 수 있습니다.

Protocol

1 부. 구체적이고 현지화된 RNAi의 대상이 Drosophila Imaginal 윙 디스크의 준비.

생물 학적 소재로, 우리는 GAL4/UAS 시스템 ^1에 의해 언어 및 특정 유전자 입을 대상이 유전자 변형 애벌레에서 얻은 Drosophila imaginal 윙 디스크를 사용했습니다. 하나 GAL4 드라이버 UAS 응답 두 번째를 가지고이 애벌레 자손은 두 부모의 라인과 관련된 유전자 십자가에서 orginates. 특정 시간적 및 / 또는 공간적 패턴에 GAL4을 표현하는 것 외에도, 드라이버 라인은 GAL4 표현 도메인을 시각화 수 UAS - GFP 기자를 수행합니다. UAS 응답 라인, UAS 시퀀스의 통제를 받고 특별히 관심을 선택한 유전자 (유전자 X 불러야 ²⁾ 타겟팅할 수 RNA (hpRNA)을 입을 헤어핀을 표현. 일단 세포로 표현, hpRNA X는 특별히 선택된 유전자를 침묵 할 수 작은 간섭 RNA (siRNA)를 생성 죽습니다. 애벌레 자손에서, 그 드라이버와 UAS - 입을 구조에만 GAL4 단백질을 표현하는 그 세포 베꼈는데는 응답 transgenes을 모두 실시하고, 따라서 선택된 유전자 X의 공간 제한 입을를 유도 수 있습니다

가능한 응용 프로그램의 다양한 가운데, 우리는 engrailed - GAL4의 통제하에 우리의 관심이 선택한 유전자 (유전자 X) (EN) 드라이버, 날개 디스크 ^3의 후부 구획에서 특정 입을를 실행할 수있는 침묵이 접근 방식을 적용 , 그의 영토는 UAS - GFP transgene의 표현에 의해 표시되었다.

침묵 imaginal 날개 디스크가 손으로 해부 특히 주변 오염 조직, 준수 tracheas를 제거하기 위해 돌보는했다. 각 절연 날개 디스크 다음 신속하고 부드럽게 선택 영역의 즉각적인 레이저 microdissection을위한 이전 처리, RNase 무료 해부 프레임으로 전달했다.

2 부. 날개 디스크의 침묵 (후부)와 unsilenced (앞쪽에) 구획에서 선택한 영역의 레이저 microdissection.

그리고 unsilenced (앞쪽에, GFP - unlabelled) 구획이 실현되었다;되면 날개 디스크 침묵 (GFP - 표시 후부)에서 특정 영역의 레이저 microdissection은 멤브레인을했다. 이것은 쉽게 모두 들어갈 수있는 영역을 그림으로 수행 되었음 디스크의 GFP - 긍정적이고 부정적인 측면 GFP -. microdissector 아래, 우리는 먼저 선택한 경계선을 잘라 만드는 GFP 양성 세포에 레이저 광선을 하였다. microdissector 선택한 속도와 전력 절감과 함께 진행지만, 조직의 선택된 영역 아래에있는 튜브에 폭포까지 그것은 수동으로 절단 범위를 좁힐 수 있습니다. 이 튜브는 GFP 양성 세포는 이후 RNA 추출을위한 준비가되도록, TRI 시약의 작은 볼륨을 포함하고 있습니다.

우리는 이후 unsilenced, GFP - 부정적인 조직에서 이에 상응하는 지역을 해부하다하기 위해, 날개 디스크의 GFP - 부정적인 측면, 반대로 절단 영역을 옮겼습니다. 다시 한번, 자동 절단 후, 우리는 수동으로 절단을 수정하기 위해 진행. 일단 상처는 RNA 추출을위한 준비 또한 GFP - 부정적인 조직이 TRI 시약에서 발견되었습니다, 완료했다.

부 3. Microdissected 조직 분야에서 RNA 추출 및 전송 프로파일.

우리는 모자에서 액체를 분리하기 위해 튜브를 늘인 다음 표준 TRI 시약 프로토콜 다음 RNA 추출을 수행하는 1 ML에 TRI 시약을 추가했습니다. 충분한 자료를 수집하기 위해, 우리는 100 imaginal 날개 디스크에있는 절단 절차를 반복했다. 5000에 대한 ^μm의이 각각 100 지역에서 시작, 우리의 수율은 RNA 1.5 μg의되었습니다. 매뉴얼 해부의 정확도는 다음 랜덤 Hexamers와 cDNA 합성하는 슈퍼 스크립트 III (Invitrogen)를 사용하여 RT - PCR에 의해 침묵과 unsilenced 샘플에서 GFP 발현을 선택하여 제어했습니다. 함께 자사의 규제 경로의 putative 대상의 사람과 침묵 유전자 X의 표현 수준을 결정하기 위해 주력하고 이후 정량 분석​​은 마스터 믹스 (Invitrogen)을 사용하여 실시간 RT - PCR에 의해 수행되었다.

Discussion

unsilenced 날개 디스크의 앞쪽에 / 후부 구획에 달성 자신의 기초 표현 수준과 관련하여, 선택된 유전자 X의 활동이 입을시 40 %까지 감소 발견되었습니다. 대조적으로, 자사의 putative 목표 (유전자 Y) 중 하나는 우리가 부정적인 유전자 X. 규제했다는 가설을 검증하기 위해 선도적인, (7 접이식 증가)까지 - 규제 대폭 발견

우리는 위에서 설명한 실험 방법이 성공적으로 다양한 규제 경로의 putative 대상의 검증에 적용할 수있는 결론을 내린다.

또한, 우리는 RNA 추출의 수율 개선이 빠른 속도로 microarray 분석에 의해화된 전송 프로파일의 특성으로 인한 것을 짐작할. 이것은 중요한 생물 학적 과정의 자세한보기를 달성하기위한 가능성을 열 것이다. 예제를 들어, 잃어버린 및 우승자 세포 클론 morphogenetic 그라디언트 ^{4, 5} 또는 셀 대회 ⁶ 과정을 밑줄 transcriptional 스위치의 지역화된 형성 더 구체적으로 해결 될 수 차동 GFP 발현에 의해 시각하실 수 있습니다. 간에 응용 프로그램이 접근 방법은 그들 고유의 조직 맥락에서 다른 세포 지역의 transcriptional 응답을 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC water	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI Reagent	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
Master Mix	Invitrogen	11761100
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9516
Chloroform	Sigma-Aldrich	C7559
Dream taq	Fermentas	EP0701
Fly strains Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).