激光显微切割的从细胞的一个子集基因表达分析中的应用果蝇永光盘

Summary

激光显微切割技术应用于基因表达谱分析果蝇翼光盘的具体车厢，本地化的RNAi

Abstract

异质性的组织已被证明是一个限制因素，可以从生物样品中产生的信息量，影响下游分析。考虑到复杂和动态的许多组织内现有的蜂窝协会，以总结在体内的相互作用深入的分子分析，必须在家乡范围内能够分析特定的细胞群。激光介导显微切割可以达到这个目标，可以明确识别和细胞，直接镜检可视化下的利益收获成功的同时保持分子的完整性。我们已应用此技术来分析定义的区域内发展的果蝇翅膀的光盘，它代表一个有利的模型系统，研究增长的控制，细胞分化和器官的基因表达。幼虫成虫光盘早熟分为前，后，背，腹车厢谱系限制边界。利用诱导GAL4 - UAS的二元表达系统，每个车厢可以具体表达适当GAL4驱动构造控制下的UAS - GFP的转基因在转基因果蝇标记。在转基因光盘，离散细胞亚群的基因表达分析可以精确地确定后介导的激光显微切割，使用荧光GFP信号引导激光切割。

各种下游应用当中，我们集中在RNA转录分析后，本地化的RNA干扰（RNAi）。随着RNAi技术的出现，绿色荧光蛋白标记可以再加上本地化的一个特定基因的敲除，使确定的特定的基因沉默的一个独立的细胞群的转录反应。为了验证这种方法，我们解剖后（绿色荧光蛋白表达标记）光盘相当于地区，和前（不知名）后，在一个广泛表达的基因P舱的区域沉默的车厢。 RNA提取从显微切割沉默和unsilenced地区和比较基因表达分析实时定量RT - PCR检测确定。我们表明，该方法可以有效地应用于果蝇成虫光盘内的细胞亚群的准确转录。事实上，大量的光盘准备RNA的来源，而一般假定细胞的同质性，这是众所周知的转录表达，可以在这些结构有很大不同，在位置信息的后果。使用本地化的荧光GFP信号引导激光切割，可进行更准确的转录分析和盈利应用于不同的应用程序，包括在其本土范围内的谈话内容截然不同的细胞谱系分析。

Protocol

第1部分。制备受到具体的和本地化的RNAi 的果蝇成虫翼光盘。

作为生物材料中，我们使用受到GAL4/UAS ^系统本地化和特定的基因沉默的转基因幼虫获得的果蝇成虫翼光盘。这幼虫的后代orginates从一个涉及到两个亲本的遗传交叉：携带GAL4的驱动器，第二的UAS响应。除了表达GAL4在一个特定的时间和/或空间格局，车手阵容进行UAS - GFP的记者说，允许GAL4表达域的可视化。 UAS的应答线表示的UAS序列的控制下，一个发夹沉默RNA（hpRNA）能够明确目标的兴趣选择的基因（称之为基因^X） 2。一旦在细胞中表达，hpRNA的X是裂解产生小干扰RNA（siRNA）能够专门选定的基因沉默。在幼虫的后代，同时携带驱动程序和响应外源基因，无人机沉默构造仅表达GAL4蛋白在这些细胞转录，从而能够诱导选定的基因十，空间限制的沉默

在各种可能的应用，我们应用这种方法 engrailed - GAL4的控制下，我们的兴趣选定的基因（基因X）（EN）驱动程序，它可以触发特定的沉默后车厢^翼光盘3，沉默标记的UAS - GFP基因的表达，其领土。

沉默成虫翼光盘手工解剖，照顾，以消除周围污染的组织，特别是坚持气管。每个隔离翼光盘，然后迅速轻轻地转移到以前治疗，核糖核酸酶对选定地区的直接激光显微切割自由清扫框架。

第2部分。激光显微切割选定的区域从沉默（后）和unsilenced（前）的机翼光盘车厢。

一旦翼光盘上的膜沉默（后GFP标记）和unsilenced（前GFP -不知名）车厢达到特定领域，激光显微切割。这是通过绘制一个区域，都可以很容易地适应执行，GFP阳性和GFP阴性光盘的两面。根据的microdissector，我们首先集中的激光束对GFP阳性组织，使沿选定的外围切。在所选定的速度和力量切割microdissector收益，但却是可能的手动完善的切割，直到选定区域组织在管底下降的。此管包含三军试剂的体积小，使GFP阳性的组织准备随后的RNA提取。

其后，我们到对面的动议切削区，GFP阴性的一侧机翼光盘，以剖析unsilenced，GFP阴性组织等效的领土。再次，自动切断之后，我们进行手动提炼削减。一旦削减完成后，GFP阴性组织恢复在三试剂，RNA提取准备。

第3部分。 RNA的提取及转录分析显微切割组织区域。

我们纺管脱离第液体和添加TRI试剂至1 ml，然后进行RNA的提取标准的三试剂协议。为了收集足够的材料，我们反复100成虫翼光盘上的切割过程。从5000微米左右各^2个 100的领域开始，我们的产量为1.5微克的RNA。手动剥离精度控制的沉默和unsilenced样品经RT - PCR检测GFP的表达，使用超级脚本III（Invitrogen）的合成与随机六聚体的cDNA。重点沉默的基因X的表达水平，连同那些公认的目标的监管途径，以确定后续定量分析，进行实时RT - PCR检测使用的master mix（Invitrogen公司）。

Discussion

尊重unsilenced翼光盘车厢前/后所取得的基础表达水平降低到40％的沉默后，对选定的基因X的活性被发现。相比之下，其公认的目标（基因Ÿ）被发现显着上调（7折的增加），导致我们要验证的假说，它是基因X.负调控

我们得出结论，上述描述的实验方法可以成功地应用到不同的调控途径的假定目标的验证。

此外，我们推测，在改善RNA提取的产量可以迅速使本地化的转录分析表征微阵列分析。这将打开的可能性，以实现一个重要的生物过程的更详细的视图。举例来说，本地化形态梯度^4，5或⁶细胞竞争的过程中转录开关强调，在那里失去和赢家细胞克隆形成可视化差GFP表达，可以更具体地解决。无论应用程序，这种方法可以帮助定义在其原生组织中不同的细胞领土的转录反应。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC water	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI Reagent	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
Master Mix	Invitrogen	11761100
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9516
Chloroform	Sigma-Aldrich	C7559
Dream taq	Fermentas	EP0701
Fly strains Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).