Laser Mikrodissektion Angewandt auf Gene Expression Profiling von Untergruppe von Zellen aus dem Drosophila Wing Disc

Summary

Laser Mikrodissektion wurde angewandt, um Gene Expression Profiling in bestimmten Kompartimenten des Drosophila Flügel Scheibe analysieren unterzogen, um lokalisierte RNAi

Abstract

Heterogene Natur des Gewebes hat sich ein limitierender Faktor bei der Menge an Informationen, die aus biologischen Proben erzeugt werden können, Kompromisse Downstream-Analysen. Angesichts der komplexen und dynamischen zellulären Verbänden bestehende in vielen Geweben, um die in vivo Interaktionen gründliche molekulare Analyse rekapitulieren muss man in der Lage sein bestimmte Zellpopulationen in ihrer Muttersprache Kontext zu analysieren. Laser-vermittelte Mikrodissektion kann dieses Ziel zu erreichen, so dass eine eindeutige Identifizierung und erfolgreichen Ernte der Zellen von Interesse unter der direkten mikroskopischen Visualisierung unter Beibehaltung molekulare Integrität. Wir haben diese Technologie angewendet, um die Genexpression in definierten Gebieten der Entwicklungsländer Drosophila Flügel Disc, die ein vorteilhaftes Modellsystem, um Wachstum zu kontrollieren, der Zelldifferenzierung und Organentwicklung Studie stellt analysieren. Larven Imaginalscheiben sind frühzeitig in die vorderen und hinteren, dorsalen und ventralen Kammern durch Abstammung Einschränkung Grenzen unterteilt. Die Nutzung der induzierbaren GAL4-UAS binärer Ausdruck System, jedes dieser Fächer können gezielt in transgenen Fliegen Ausdruck einer UAS-GFP-Transgen unter der Kontrolle der entsprechenden GAL4-Treiber bauen gekennzeichnet werden. In den transgenen Discs können Genexpressionsanalysen von diskreten Untergruppen von Zellen genau nach Laser-vermittelte Mikrodissektion bestimmt werden, mit dem fluoreszierenden GFP-Signal an lasergeschnittenen führen.

Unter der Vielzahl der nachgelagerten Anwendungen, konzentrierten wir uns auf RNA-Transkript Profilierung nach lokalisierten RNA-Interferenz (RNAi). Mit dem Aufkommen der RNAi-Technologie können GFP-Markierung mit lokalisierten Knockdown von einem bestimmten Gen gekoppelt werden, so dass der Transkriptions-Reaktion eines diskreten Zellpopulation, die Gen-Silencing bestimmten. Zur Validierung dieses Ansatzes haben wir entsprechende Bereiche der Scheibe aus dem hinteren (gekennzeichnet durch die GFP-Expression) zerlegt, und die anterior (unbeschriftet) Fach auf regionaler Silencing in der P-Fach eines ansonsten ubiquitär exprimierten Gen. RNA wurde aus mikrodissezierten zum Schweigen gebracht und unsilenced Bereichen und vergleichende Genexpressionsanalysen mittels quantitativer real-time RT-PCR bestimmt extrahiert. Wir zeigen, dass diese Methode effektiv für eine genaue Transkriptomik von Teilmengen von Zellen innerhalb des Drosophila Imaginalscheiben angewendet werden. In der Tat, während der massive Scheibe Zubereitung als Quelle der RNA in der Regel davon ausgegangen Zelle Homogenität, ist es bekannt, dass transkriptionelle Expression kann stark variieren innerhalb dieser Strukturen in Folge der Positionsinformationen. Mit lokalisierten fluoreszierenden GFP-Signal an lasergeschnittenen Führer, können genauere transkriptionelle Analysen durchgeführt werden und profitabel zu verschiedenen Anwendungen, einschließlich Abschrift Profilierung der verschiedenen Zelllinien in ihrer Muttersprache Kontext angewendet.

Protocol

Teil 1. Vorbereitung von Drosophila Imaginal Flügel Discs unterzogen Spezifische und lokalisierte RNAi.

Als biologisches Material verwendeten wir Drosophila imaginalen Flügel Scheiben aus transgenen Larven unterzogen, um die lokale und spezifische Gen-Silencing durch die GAL4/UAS System ¹ erhalten. Diese Larven Nachkommen entstammt das aus einer genetischen Kreuzung mit zwei elterlichen Linien: eine Durchführung der GAL4-Treiber, der zweite die UAS-Responder. Neben GAL4 in einem bestimmten zeitlichen und / oder räumliche Muster auszudrücken, trägt der Fahrer Linie ein UAS-GFP-Reporter, dass die GAL4 Ausdruck Domain visualisieren können. Die UAS-Responder Linie drückt, unter der Kontrolle des UAS-Sequenz, eine Haarnadel-Silencing RNA (hpRNA) in der Lage, gezielt ausgewählten Gen von Interesse (nennen wir es Gen X) ^2. Einmal in der Zelle exprimiert wird, ist die hpRNA X gespalten small interfering RNA (siRNA) in der Lage, gezielt Stille des ausgewählten Gens zu erzeugen. In den Larven Nachkommen führt, dass beide Fahrer und Responder Transgene, die UAS-Silencing-Konstrukt nur in jenen Zellen, die das GAL4-Protein transkribiert wird, und ist somit in der Lage, eine räumlich beschränkte Schweigen des ausgewählten Gens X. induzieren

Unter der Vielzahl der möglichen Anwendungen, wandten wir diesen Ansatz zu einem ausgewählten Gen unseres Interesses (Gen X) unter der Kontrolle des engrailed-GAL4 (en)-Treiber, welche spezifischen Silencing in der hinteren Kammer des Flügels Scheibe ³ auslösen kann Stille , wurde dessen Gebiet durch die Expression der UAS-GFP-Transgen markiert.

Das Schweigen imaginalen Flügel Scheiben wurden von Hand zerlegt, wobei darauf zu achten Umgebung kontaminieren Geweben, insbesondere die Einhaltung Luftröhre zu beseitigen. Jeder isolierte Flügel Scheibe wurde dann schnell und schonend zu einem bereits behandelten, RNase frei Dissektion Rahmen für die sofortige Lasermikrodissektion ausgewählter Bereiche übertragen.

Part 2. Laser Mikrodissektion ausgewählte Bereiche aus dem Schweigen (posterior) und unsilenced (anterior) Fächer des Flügels Scheibe.

Sobald die Flügel Scheibe wurde auf der Membran-, Laser-Mikrodissektion von bestimmten Bereichen aus Schweigen (posterior; GFP-markierten) und unsilenced (anterior, GFP-unbeschriftet) Fächer wurde erreicht. Dies wurde durch Zeichnung einer Fläche, die leicht in beide passen könnte durchgeführt, die GFP-positiven und GFP-negativen Seiten der Scheibe. Unter dem Microdissector wir zunächst fokussiert den Laserstrahl auf die GFP-positiven Gewebe, so dass ein Schnitt entlang der gewählten Umfang. Die Microdissector Erlöse mit Schneiden in der gewählten Geschwindigkeit und Kraft, aber es ist möglich, das Schneiden von Hand zu suchen, bis der ausgewählte Bereich des Tissue fällt in die Röhre darunter. Diese Röhre enthält eine kleine Menge des TRI-Reagenz, so dass die GFP-positiven Gewebe bereit für die anschließende RNA-Extraktion ist.

Wir Anschließend wechselte der Schnittfläche auf die gegenüberliegende, GFP-negative Seite des Flügels Disc, um ein gleichwertiges Gebiet von der unsilenced, GFP-negativen Gewebe zu sezieren. Wieder einmal, nach der Abschaltautomatik, begaben wir uns zur Verfeinerung der Schnitt manuell. Sobald der Schnitt gemacht wurde, auch die GFP-negativen Gewebe wurde in der TRI Reagent erholt, bereit für die RNA-Extraktion.

Teil 3. RNA-Extraktion und Transkription Profiling von mikrodissezierten Tissue Areas.

Wir gesponnen die Rohre, um die Flüssigkeit aus der Kappe lösen und fügte TRI-Reagenz bis zu 1 ml, dann erfolgt die RNA-Extraktion nach dem Standard TRI Reagenz-Protokoll. Um genügend Material zu sammeln, wiederholten wir den Schneidvorgang auf 100 imaginalen Flügel-Discs. Ausgehend von 100 Gebieten von etwa 5000 um je ^2, war unsere Ausbeute von 1,5 pg RNA. Genauigkeit der manuellen Dissektion wurde dann, indem die GFP-Expression in den zum Schweigen gebracht und unsilenced Proben durch RT-PCR kontrolliert, mit Super-Script III (Invitrogen) zu synthetisieren cDNA mit Random Hexameren. Nachfolgende quantitative Analysen konzentrieren, um die Expression des Gens Schweigen X bestimmen, zusammen mit denen von vermeintlichen Ziele ihres Regulationsweg, wurden durch Real Time RT-PCR unter Verwendung von Master Mix (Invitrogen) durchgeführt.

Discussion

Mit Bezug auf ihre basale Expression in der vorderen / hinteren Abteile unsilenced Flügel Scheiben erreicht, wurde die Aktivität des ausgewählten Gens X gefunden reduziert auf 40% bei Schweigen. Im Gegensatz dazu war eine seiner vermeintlichen Ziele (Gene Y) deutlich hochreguliert (7-facher Anstieg) gefunden, was uns zu der Hypothese bestätigen, dass es negativ wurde von Gen X. geregelt

Wir schließen daraus, dass die oben beschriebenen experimentellen Ansatz erfolgreich auf die Validierung von vermeintlichen Ziele der verschiedenen Regulationsmechanismen angewendet werden.

Darüber hinaus vermuten wir, dass eine Verbesserung der Ausbeute an RNA-Extraktion konnte schnell ermöglichen eine Beschreibung der lokalisierten Transkriptionsprofilierung von Microarray-Analyse. Dies öffnet die Möglichkeit, eine detailliertere Ansicht der wichtigen biologischen Prozessen zu erreichen. So können beispielsweise die lokale Bildung von morphogenetischen Gradienten ^{4, 5} oder der transkriptionellen Schalter unterstreicht den Prozess der Zelle Wettbewerb ^6, wo und zu verlieren Gewinner Zellklone visualisiert werden durch Differential-GFP-Expression, könnte genauer angesprochen werden. Unabhängig von der Anwendung, kann dieser Ansatz dazu beitragen, die transkriptionelle Reaktion der verschiedenen zellulären Gebiete in ihrem nativen Gewebe Kontext zu definieren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC water	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI Reagent	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
Master Mix	Invitrogen	11761100
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9516
Chloroform	Sigma-Aldrich	C7559
Dream taq	Fermentas	EP0701
Fly strains Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
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