Het meten van de 50% Hemolytische Complement (CH ₅₀) Activiteit van Serum

Summary

De klassieke route wordt geactiveerd door antilichaam en culmineert in target cel lysis. De CH

Abstract

Het complement systeem is een groep eiwitten die indien geactiveerd leiden tot cel-lysis doelgroep en bevordert fagocytose door opsonisch. Individuele complement componenten kunnen worden gekwantificeerd maar dit geen informatie over de activiteit van het pad te bieden. De CH

Protocol

De voorbereiding van 5x Veronal Buffered Saline (VBS)

1. Ter voorbereiding van de Veronal gebufferde fysiologische zoutoplossing (VBS), drie afzonderlijke oplossingen moeten worden voorbereid.
2. Maak een oplossing een door het oplossen van 21.25gm van NaCl en 0.94gm van natrium Barbitone in 350 ml gedestilleerd water. De uiteindelijke concentratie van NaCl en Natrium Barbitone zijn 1,02 m en 13 mm respectievelijk.
3. Maak een oplossing 2 door het oplossen van 1.44gm van Barbitone in 125 ml warm gedestilleerd water. De uiteindelijke concentratie van Barbitone is 62,5 mm.
4. Bereid oplossing 3 door het oplossen van 20.33gm van MgCl ₂ en 4.41gm van CaCl ₂ in 100 ml gedestilleerd water. De uiteindelijke concentratie van MgCl ₂ en CaCl ₂ is 2,18 m en 440mm respectievelijk.
5. Mix oplossingen 1 en 2 en laat afkoelen tot kamertemperatuur.
6. Zodra de gecombineerde oplossing is afgekoeld, voeg 1,25 ml van de oplossing 3 en pH 7.3-7.5 met 1M HCl.
7. Pas het uiteindelijke volume tot 500 ml met gedestilleerd water tot een 5x voorraadoplossing te bereiden.
8. Ter voorbereiding op een 1x werkende oplossing verdunnen de voorraad 01:05 met gedestilleerd water.

Sensibilisatie van de rode bloedcellen van schapen met haemolysine

1. Bereid de haemolysine door eerst verdunnen 1:50 met VBS
2. Om 4ml van SRBC toe te voegen 6 ml van de VBS en meng door de inversie
3. Centrifugeer bij 600g x 5 minuten
4. Verwijder het supernatant en was de cellen nog 2 keer
5. Na de laatste wasbeurt, centrifuge de cellen op 900g x 5 minuten om de cellen te pakken
6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in voldoende VBS naar een 10% oplossing dat wil zeggen 0,5 ml van verpakte cellen voor te bereiden zijn geresuspendeerd in 5 ml buffer
7. Druppelsgewijs toe te voegen een gelijk volume van haemolysine (konijn anti-schapen rode bloedcellen antilichaam) om de cellen, terwijl wervelende continu
8. Incubeer bij 30 ° C gedurende 30 minuten in een waterbad
9. Meng de cellen elke 15 minuten
10. Lichtgevoelig SRBC 's nachts kan worden opgeslagen bij 4 ° C

CH ₅₀ assay

1. Label een reeks buizen in tweevoud met 1:08, 1:16, 1:32, 1:64 en 1:128.
2. Maak een reeks tweevoudige seriële verdunningen van controle en testserum in VBS elk in duplo
3. Begin bij 1:4 (100 ml serum + 300 ml VBS) en de overdracht van 200 ml monster in de volgende gemerkte buis.
4. Meng goed tussen de verdunningen en overdracht 200ml naar de volgende verdunning met een frisse pipetpunt.
5. Herhaal dit totdat alle vijf verdunningen worden gemaakt.
6. Gooi 200ml uit de laatste 1:128 verdunning.
7. Voeg 200 ml van zwevende gevoelig SRBC aan alle buizen.
8. Label twee aparte buizen als blanco en voeg 200 ml van de gesensibiliseerde SRBC + 200ml VBS. Deze buizen zullen meten spontane lysis van de SRBC in de VBS.
9. Label nog twee aparte buizen als TOTAL lysis en voeg 200 ml van de gesensibiliseerde SRBC + 200 ml gedestilleerd water.
10. Voorzichtig mengen alle buizen.
11. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten in een waterbad mengen na 15 minuten.
12. Centrifugeer de monsters bij 1.500 g gedurende 5 minuten om het sediment van de RBC's.
13. Overdracht van 100 ml supernatans van elke buis tot een goed in een 96 goed vlakke bodemplaat.
14. Voeg 100 ml gedestilleerd water toe aan elk putje.
15. Lees de absorptie van de monsters op 540nm behulp van een plaat spectrofotometer.

Berekeningen

1. Bereken de gemiddelde absorptie voor elk monster
2. Trek de BLANK absorptie (spontane lysis) van alle monsters
3. Bereken de% lysis voor elke verdunning met de volgende formule:
   
4. Plot van het percentage lysis (verticale as) ten opzichte van de serumverdunning op de horizontale as.
5. Bereken de verwatering die nodig is voor 50% hemolyse voor de controle en test serum (figuur 2).

Representatieve resultaten:

De video bevat een voorbeeld van representatieve resultaten. In de praktijk wordt een controle serum ook draaien op hetzelfde moment als de test serum en wordt behandeld op dezelfde manier. Hieronder (tabel 1) is een voorbeeld van gegevens van een reeds beproefd serummonster. De gegevens worden gemanipuleerd op basis van de vergelijking die in 5.3.

Monster	OD 540	Betekenen
Blanco	0.042, 0.044	0.043
Totaal lysis	0.183, 0.183	0.183
Verdunning	OD 540	Betekenen	Mean-Blank	% Lysis
01:08	0.200, 0.219	0.210	0.168	116
01:16	0.179, 0.173	0.176	0.134	93
01:32	0.134, 0.110	0.122	0.08	55
1:64	0.053, 0.066	0.059	0.017	12
1:128	0.044, 0.045	0.045	0.003	2

Figuur 1. Activatie van de klassieke complement route. De klassieke route wordt geactiveerd door binding immunoglobuline-M (IgM) of immunoglobuline-G (IgG) op het oppervlak van een doelcel. Het Fc-gedeelte van de Ab bindt aan C1q, is C1r geactiveerd en dit op zijn beurt activeert een ander molecuul van C1r die samen activeert twee moleculen van C1s. C1S splitst nu C4, die de bindingsplaats voor C2, die ook wordt gesplitst bloot. De binding van C4b en C2a leidt tot de vorming van een complex aangeduid als een C3 convertase. Dit complex splitst nu C3 vormen C3a en C3b, waarvan sommige te combineren met de C3 convertase de vorming van een C5 convertase. Dit complex werkt nu op de C5, met de daaruit voortvloeiende C5b binding aan C6 de inleiding van de vorming van het membraan attack complex (MAC). C5b6 inwerkt op C7, die op hun beurt inwerken op C8 en uiteindelijk op de C9 resulteert in de vorming van de uiteindelijke MAC. (Goldsby et al., 2003).

Figuur 2. Plotten van het monster gegevens en het berekenen van de CH50 voor een controle en test serum monster. (A), worden de berekende percentage (%) lysis van zowel de controle (•) en test () serum monsters uitgezet tegen verdunningsfactor. (B) Voor het berekenen van de 50% lysis, is een lijn van de 50% procent de waarde tot het snijpunt met de grafiek lijnen en vervolgens een verticale lijn getrokken naar de verwatering. In dit voorbeeld zijn een 35-voudige verdunning van de controle en de 21.6-voudige verdunning van de test serum vereist is om 50% lysis te bereiken. Deze data geeft aan dat er minder aanvulling aanwezig is in de test serum in vergelijking met de controle als het nodig is minder verwatering voor 50% lysis werd bereikt. De te controleren steekproef toont ook aan> 100% lysis bij de 1:08 verdunning. Dit is het meest waarschijnlijk te wijten aan onvolledige lysis van de SRBC door het Gedistilleerd water en efficiënter lysis door het complement componenten.

Discussion

De CH ₅₀ test is onderworpen aan vele storingen. Sommige SRBC zijn kwetsbaarder dan anderen, wat resulteert in spontane hemolyse, dat is niets om de activiteit aan te vullen. De affiniteit van het konijn antilichaam varieert van partij tot partij en van een fabrikant naar de andere, dit heeft invloed op de hoeveelheid antilichaam dat bindt aan de SRBC. Ook het proces van sensibiliserende SRBC met antilichaam resultaten in cellen met verschillende hoeveelheden antilichaam coating de SRBC. Specimen verzameling en opslag zijn een belangrijke potentiële bron van fouten. Complement componenten zoals C1q, C3, C4 en C5 zijn uiterst labiel, zodat de juiste behandelen van het monster is van cruciaal belang. Langdurige blootstelling aan hitte zal afnemen aanvulling activiteit en zal produceren inactieve fragmenten van complement componenten. Voor het detecteren van zoveel mogelijk bronnen van fouten mogelijk te maken, is het essentieel om een controle serum test met een bekende CH _50-waarde elke keer dat de test is uitgevoerd en de geaccepteerde waarde van de bekende serum controle te reproduceren. Een manier om te bepalen of er verschillen zijn tussen verschillende charges van SRBC en haemolysine is om nieuwe test materialen tegen een standaard steekproef van serum een paar keer testen en dan bepalen of er eventuele wijzigingen in de basale niveau van hemolyse of in de CH _50-waarde voor de controle serum.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sheep red blood cells	CSL	2490201	Use at 1% final
Serum			Human serum
Rabbit Anti-Sheep Haemolytic serum (RBCs), Unconjugated	AbD Serotec	C12HSB
96 well flat bottom plate	Sarstedt Ltd	83.1839
Veronal buffered saline			Use at 1x final
Waterbath
Plate reader
37°C room/incubator