Die Messung der 50% Hämolytische Complement (CH ₅₀) Aktivität von Serum

Summary

Der klassische Weg wird durch Antikörper aktiviert und gipfelt in Ziel-Zell-Lyse. Die CH

Abstract

Das Komplementsystem ist eine Gruppe von Proteinen, die bei Aktivierung führen zu Zelllyse Ziel und erleichtert die Phagozytose durch Opsonisierung. Individuelle Komplement-Komponenten quantifiziert Dies bedeutet jedoch keine Auskunft über die Aktivität der Weg sein. Die CH

Protocol

Vorbereitung von 5x Veronal Buffered Saline (VBS)

1. Zur Vorbereitung der Veronal-gepufferte Kochsalzlösung (VBS), müssen drei separate Lösungen vorbereitet werden.
2. Bereiten Sie die Lösung 1 durch Auflösen 21.25gm von NaCl und 0.94gm von Sodium barbiturathaltiges Mittel in 350ml destilliertem Wasser. Die Endkonzentrationen von NaCl und Natrium barbiturathaltiges Mittel sind 1,02 M und 13mm bzw..
3. Bereiten Sie die Lösung 2 durch Lösen 1.44gm von barbiturathaltiges Mittel in 125ml destilliertem Wasser heiß. Die Endkonzentration der barbiturathaltiges Mittel ist 62.5mm.
4. Bereiten Lösung 3 durch Auflösen 20.33gm von MgCl ₂ und 4.41gm von CaCl ₂ in 100 ml destilliertem Wasser. Die Endkonzentration von MgCl ₂ und CaCl ₂ ist 2,18 m und 440 jeweils.
5. Mix-Lösungen 1 und 2 und auf Raumtemperatur abkühlen.
6. Sobald die kombinierte Lösung abgekühlt ist, fügen Sie 1,25 ml der Lösung 3 und pH-Wert auf 7,3-7,5 mit 1 M HCl.
7. Passen Sie das endgültige Volumen auf 500 ml mit destilliertem Wasser auf einem 5-fach Stammlösung.
8. So bereiten Sie eine 1x funktionierende Lösung, verdünnte die Aktie im Verhältnis 1:5 mit destilliertem Wasser.

Sensibilisierung von Schafs-Erythrozyten mit Hämolysin

1. Bereiten Sie das Hämolysin, indem zunächst Verdünnung 1:50 mit VBS
2. Um 4 ml SRBC hinzufügen 6ml des VBS und vorsichtig durch Umdrehen mischen
3. Zentrifugation bei 600g x 5 Minuten
4. Überstand verwerfen und die Zellen weitere 2 Mal
5. Nach dem letzten Waschen Zentrifuge die Zellen bei 900g x 5 Minuten, um die Zellen-Pack
6. Überstand verwerfen und Zellen in ausreichender VBS zu einer 10% igen Lösung, dh 0,5 ml gepackte Zellen herzustellen, sind in 5 ml Puffer
7. Tropfenweise das gleiche Volumen von Hämolysin (Kaninchen Anti-Schaf-Erythrozyten-Antikörper), um die Zellen während wirbelnde kontinuierlich
8. Inkubation bei 30 ° C für 30 Minuten in einem Wasserbad
9. Vorsichtig mischen die Zellen alle 15 Minuten
10. Sensibilisiert SRBC kann über Nacht bei 4 ° C gelagert werden

CH _50-Test

1. Label eine Reihe von Röhren in zweifacher Ausfertigung mit 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 und 1:128.
2. Bereiten Sie eine Reihe von zwei fache serielle Verdünnungen von Kontroll-und Test-Serum in VBS jeweils im Doppel
3. Start bei 1:4 (100ml Serum + 300ml VBS) und Transfer 200ml Probe in den nächsten markierten Röhre.
4. Nach gründlichem Mischen zwischen Verdünnungen und Transfer 200ml zum nächsten Verdünnung mit einer frischen Pipettenspitze.
5. Wiederholen, bis alle fünf Verdünnungen hergestellt werden.
6. Discard 200ml von der endgültigen 1:128 Verdünnung.
7. Add 200 ml suspendiert sensibilisiert SRBC allen Rohren.
8. Label zwei getrennten Röhren als BLANK und fügen 200ml sensibilisierter SRBC + 200ml VBS. Diese Rohre messen spontane Lyse der SRBC im VBS.
9. Label anderen zwei getrennten Röhren als TOTAL Lyse und fügen Sie 200 ml sensibilisiert SRBC + 200ml destilliertem Wasser.
10. Vorsichtig mischen allen Rohren.
11. Bei 37 ° C für 30 Minuten in einem Wasserbad Mischen nach 15 Minuten.
12. Zentrifugieren Sie die Proben bei 1.500 g für 5 Minuten in das Sediment des RBC.
13. Transfer 100ml Überstand aus jeder Röhre ein gut in einer 96-well ebenen Bodenplatte.
14. Add 100 ml destilliertem Wasser in jede Vertiefung.
15. Lesen Sie die Absorption der Proben bei 540 nm mit einer Platte Spektralphotometer.

Berechnungen

1. Berechnen Sie die mittlere Absorption für jede Probe
2. Subtrahieren Sie die BLANK Absorption (spontane Lyse) von allen Proben
3. Berechnen Sie den% Lyse für jede Verdünnung mit folgender Formel:
   
4. Zeichnen Sie die prozentuale Lyse (vertikale Achse) gegen die Serumverdünnung auf der horizontalen Achse.
5. Berechnen Sie die Verwässerung für die 50% ige Hämolyse für die Steuerung und Testserum (Abb. 2) benötigt.

Repräsentative Ergebnisse:

Das Video enthält ein Beispiel für repräsentative Ergebnisse. In der Praxis wird ein Kontrollserum auch zur gleichen Zeit wie die Testserum geführt und ist in der gleichen Weise behandelt. Below (Tabelle 1) Sample-Daten aus einer getesteten Serumprobe. Die Daten werden nach der Gleichung in 5.3 vorgestellt manipuliert.

Probe	OD 540	Bedeuten
Leer	0,042, 0,044	0,043
Insgesamt Lyse	0,183, 0,183	0,183
Verdünnung	OD 540	Bedeuten	Mean-Blank	% Lysis
01.08	0,200, 0,219	0,210	0,168	116
01.16	0,179, 0,173	0,176	0,134	93
01.32	0,134, 0,110	0,122	0,08	55
1:64	0,053, 0,066	0,059	0,017	12
1:128	0,044, 0,045	0,045	0,003	2

Abbildung 1. Die Aktivierung des klassischen Komplementweges. Der klassische Weg wird durch die Bindung Immunglobulin-M (IgM) oder Immunglobulin-G (IgG) auf der Oberfläche einer Zielzelle aktiviert. Der Fc-Teil des Ab bindet C1q, ist C1r aktiviert und dies wiederum aktiviert ein anderes Molekül C1r die zusammen aktivieren zwei Moleküle C1s. C1s spaltet C4 nun die Bindungsstelle für C2, die ebenfalls gespalten wird entlarvt. Die Bindung von C4b und C2a führt zur Bildung eines Komplexes bezeichnet als C3-Konvertase. Dieser Komplex jetzt spaltet C3 bildet C3a und C3b, von denen einige mit dem C3-Konvertase Bildung einer C5 Konvertase kombinieren. Dieser Komplex wirkt nun auf C5, mit den daraus resultierenden C5b Bindung an C6 initiieren die Bildung der Membran-Angriffs-Komplex (MAC). C5b6 wirkt auf C7, was wiederum wirken auf C8 und letztlich auf C9, was zur Bildung des endgültigen MAC. (Goldsby et al, 2003).

Abbildung 2. Plotten von Sample-Daten und die Berechnung der CH50 für eine Steuer-und Testserumprobe. (A), sind die berechneten Prozentsatz (%) Lyse sowohl der Kontrollgruppe (•) und test () Serumproben gegen Verdünnungsfaktor aufgetragen. (B) Für die Berechnung der 50%-Lyse ist eine Linie von der 50% Prozent-Wert gezogen, bis sie mit dem Graphen Geraden schneidet und dann eine senkrechte Linie nach unten, um die Verdünnung gezogen. In diesem Beispiel werden ein 35-facher Verdünnung der Kontroll-und 21,6-fachen Verdünnung des Testserum verpflichtet, 50% Lyse zu erreichen. Diese Daten deuten darauf hin, dass es weniger Ergänzung im Testserum verglichen mit der Kontrollgruppe, da sie weniger Verdünnung erforderlich, bevor 50% Lyse wurde erreicht. Die Kontrollprobe zeigt auch> 100% Lyse bei der 1:8 Verdünnung. Dies ist wahrscheinlich aufgrund von unvollständigen Lyse der SRBC durch das destillierte Wasser und effizientere Lyse durch den Komplement-Komponenten.

Discussion

Die CH _50-Test unterliegt vielen Störungen. Einige SRBC sind empfindlicher als andere, was zu spontanen Hämolyse, die nicht mit Aktivitäten zu ergänzen ist. Die Affinität der Kaninchen-Antikörper variiert von Charge zu Charge und von einem Hersteller zum anderen, dies beeinflusst die Höhe des Antikörper, der an der SRBC bindet. Auch der Prozess der Sensibilisierung SRBC mit Antikörper Ergebnisse in Zellen mit unterschiedlichen Mengen der Antikörper-Beschichtung der SRBC. Gewinnung und Lagerung sind ein wichtiger potentielle Fehlerquelle. Komplement-Komponenten z. B. C1q, C3, C4 und C5 sind sehr labil, so richtige Handhabung der Proben von entscheidender Bedeutung. Länger andauernde Einwirkung von Wärme verringert Komplement-Aktivität und wird inaktive Fragmente des Komplement-Komponenten zu produzieren. Um festzustellen, wie viele Fehlerquellen wie möglich, ist es entscheidend zu einem Kontrollserum mit einer bekannten CH _50-Wert testen jedes Mal, wenn der Test durchgeführt wird, und der angenommene Wert der bekannten Serum Kontrolle zu reproduzieren. Eine Möglichkeit, um festzustellen, ob es irgendwelche Unterschiede zwischen verschiedenen Chargen von SRBC und Hämolysin sind ist es, neue Materialien testen gegen eine Standard-Probe von Serum mehrmals testen und dann entscheiden, ob es irgendwelche Änderungen in der basalen Ebene der Hämolyse oder in der CH _50-Wert sind für das Kontrollserum.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sheep red blood cells	CSL	2490201	Use at 1% final
Serum			Human serum
Rabbit Anti-Sheep Haemolytic serum (RBCs), Unconjugated	AbD Serotec	C12HSB
96 well flat bottom plate	Sarstedt Ltd	83.1839
Veronal buffered saline			Use at 1x final
Waterbath
Plate reader
37°C room/incubator