Summary
Klasik yolu antikor tarafından aktif ve hedef hücre parçalama içinde sona eriyor. CH
Abstract
Kompleman sistemi, hücre parçalama hedef yol opsonisation yoluyla aktif ve fagositoz kolaylaştırır proteinlerin bir grup. Bireysel kompleman, ancak bu yolun aktivite olarak herhangi bir bilgi sağlamaz belirlenebilir. CH
Protocol
5x veronal Tamponlu Salin (VBS) hazırlanması
- Veronal Tamponlu Salin (VBS) hazırlamak için, üç ayrı çözüm hazırlıklı olması gerekiyor.
- Distile su 350ml Sodyum barbital NaCl ve 0.94gm 21.25gm çözme çözüm 1 hazırlayın. NaCl ve sodyum barbital son konsantrasyonları sırasıyla 1.02m ve 13mm.
- Barbital, 125ml sıcak distile su 1.44gm eriterek çözüm 2 hazırlayın. Barbital son konsantrasyon 62.5mm.
- Distile su 100 ml CaCl 2 MgCl 2 ve 4.41gm 20.33gm eriterek çözüm 3 hazırlayın. MgCl 2 ve CaCl 2 final konsantrasyon sırasıyla 2,18 m ve 440mm.
- Mix çözüm 1 ve 2 ve oda sıcaklığına kadar soğumasını.
- Kombine çözüm soğuduktan sonra, çözüm 3 1.25ml eklemek ve pH 7,3-7,5 1M HCl kullanarak ayarlayabilirsiniz.
- 5x bir stok solüsyonu hazırlamak için 500ml için son hacim distile su ile ayarlayın.
- 1x çalışma çözeltisi hazırlamak için, saf su ile seyreltilmiş hisse 01:05.
Haemolysin koyun kırmızı kan hücreleri, Duyarlayıcılık
- Öncelikle VBS ile 01:50 sulandırmaya haemolysin hazırlayın
- SRBC için 4ml VBS 6ml ekleyin ve yavaşça tersine çevirerek karıştırın
- 600g x 5minutes santrifüjleyin
- Süpernatantı atın ve hücrelerin başka bir 2 kez yıkayın
- Son yıkamadan sonra, hücreleri paketi 900g x 5minutes hücreler santrifüj
- Paketlenmiş hücrelerinin% 10 çözüm yani 0.5 ml hazırlamak için yeterli VBS hücrelerin tekrar süspansiyon supernatant atın ve 5 ml tampon yeniden süspanse
- Sürekli dönen hücrelere haemolysin eşit hacmi (tavşan anti-koyun kırmızı kan hücresi antikor) eklemek Damlatarak
- Bir su banyosunda 30 dakika süreyle 30 ° C'de inkübe
- Yavaşça hücreler her 15 dakika bir arada
- Hassas SRBC 4 geceleme saklanabilir ° C
CH 50 tahlil
- 1:08, 1:16, 1:32, 1:64 ve 1:128 ile yinelenen tüpler bir dizi etiketleyin.
- Nüsha halinde, her VBS kontrol ve test serum iki kat seri dilüsyonları bir dizi hazırlayın
- 01:04 'da başlayacak (100ml serum + 300ml VBS) ve sonraki etiketli tüpe örnek 200ml aktarmak.
- Taze bir pipet ucu ile sonraki seyreltme dilüsyonları ve transfer 200ml arasında iyice karıştırınız.
- Beş dilüsyonları yapılıncaya kadar bu işlemi tekrarlayın.
- Son 1:128 dilüsyon 200ml atın.
- Tüm tüpler askıya sensitize SRBC 200ml ekleyin.
- Etiket iki ayrı tüpler gibi BLANK ve hassaslaşmış SRBC + 200ml VBS 200ml eklemek. Bu tüpler VBS SRBC spontan lizis ölçecek.
- TOPLAM lizis olarak başka iki ayrı tüpler Etiket ve sensitize SRBC + 200ml distile su 200ml eklemek.
- Tüm tüpler hafifçe karıştırın.
- 37 ° C'de 15 dakika sonra karıştırılarak su banyosunda 30 dakika inkübe edin.
- Tortu eritrositlerde 5 dakika boyunca 1.500 g örnekleri santrifüjleyin.
- 96 sıra düz dipli plaka her tüp süpernatant 100ml iyi transfer.
- Her bir kuyunun 100 ml distile su ekleyin.
- 540nm bir tabak spektrofotometre kullanılarak örneklerin absorbans okuyun.
Hesaplamalar
- Her bir örnek için ortalama absorbans hesaplayın
- Tüm örneklerde BLANK absorbans (kendiliğinden lizis) çıkarma
- Aşağıdaki formül kullanılarak her dilüsyon için% lizis hesaplayın:
- Yatay eksende serum seyreltme karşı yüzde lizis (dikey eksen) çizilir.
- Kontrol ve test serum (Şekil 2) için% 50 hemoliz için gerekli seyreltme hesaplayın.
Temsilcisi Sonuçlar:
Video temsilcisi sonuçlar bir örnek içerir. Uygulamada, bir kontrol serumu da test serum olarak aynı anda çalıştırmak ve aynı şekilde tedavi edilir. Aşağıda (Tablo 1), test edilmiş bir serum örneği örnek veri. 5.3 'te sunulan denkleme göre veri değiştirilebilir.
| Örnek | OD 540 | Ortalama | ||
| Boş | 0.042, 0.044 | 0,043 | ||
| Toplam lizis | 0.183, 0.183 | 0,183 | ||
| OD 540 | Ortalama | Boş Ortalama- | % Lizis | |
| 01:08 | 0.200, 0.219 | 0,210 | 0,168 | 116 |
| 01:16 | 0.179, 0,173 | 0,176 | 0,134 | 93 |
| 01:32 | 0.134, 0.110 | 0,122 | 0,08 | 55 |
| 1:64 | 0,053, 0,066 | 0,059 | 0,017 | 12 |
| 1:128 | 0.044, 0.045 | 0,045 | 0,003 | 2 |
Şekil 1. Klasik kompleman yolunun aktivasyonu klasik bir yolu, bir hedef hücre yüzeyinde bağlayıcı immünglobulin M (IgM) veya immünglobulin-G (IgG) tarafından aktive edilir. Ab Fc kısmı C1q bağlar C1r aktif ve bu da birlikte iki molekül C1S aktive C1r başka bir molekülü harekete geçirir. C1S şimdi de bölünmüş C2 için bağlayıcı bir site ortaya C4 parçalayarak. C4b ve C2A bağlayıcı C3 konvertaz olarak adlandırılan bir kompleks oluşumuna yol açar. Bu karmaşık bir C5 konvertaz oluşturan C3 konvertaz ile birleşerek bazıları C3 şekillendirme C3a ve C3b keser. Bu kompleks, C6 membran atak kompleksi (MAC) oluşumunu başlatmak bağlayıcı çıkan C5b, C5 davranır. C5b6 eylemleri, C7, C8 açmak hareket ve sonuçta C9 son MAC oluşumu ile sonuçlanan. (Goldsby ve ark, 2003).
Şekil 2. Örnek verileri çizilmesi ve bir kontrol ve test serum örneği için CH50 hesaplanırken (A), (•) kontrol ve test () serum örnekleri hem de hesaplanan yüzde (%) lizis dilüsyon faktörüyle karşı çizilmiştir. Grafik hatları ile kesişiyor ve sonra seyreltme aşağı dikey bir çizgi çizilir kadar (B)% 50 lizis hesaplamak için,% 50 oranında değer bir çizgi çizilir. Bu örnekte, kontrol ve 21,6 kat seyreltme test serum 35 kat seyreltme% 50 lizis ulaşmak için gereklidir. Bu veriler test serum,% 50 lizis ulaşmıştır önce daha az sulandırma gerektiği gibi kontrol ile karşılaştırıldığında daha az tamamlayıcı olduğunu gösterir. Kontrol örneği de 01:08 seyreltme>% 100 lizis gösterir. Bu tamamlayıcı bileşenleri tarafından Damıtılmış su ve daha verimli lizis SRBC eksik lizis nedeniyle büyük olasılıkla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CH 50 testinin pek çok etkileşimler tabi. Bazı SRBC tamamlayan ilişkisiz spontan hemoliz, diğerlerine göre daha kırılgan. Tavşan antikoru yakınlığı çok çok ve bir üreticiden diğerine değişir; bu SRBC bağlar antikor miktarını etkiler. Ayrıca, farklı miktarlarda antikor kaplama SRBC hücrelerinde antikor sonuçları ile SRBC duyarlılaştırıcı süreci. Örnek toplama ve depolama hatası önemli bir potansiyel kaynak vardır. Kompleman örneğin C1q, C3, C4 ve C5 son derece dayanıksız olan, bu nedenle uygun numune alma kritik öneme sahiptir. Isıya uzun süre maruz kalmak, tamamlayıcı etkinliği azalacak ve kompleman inaktif parçaları üretecek. Mümkün olduğu kadar çok sayıda hata kaynağı olarak algılamak için, bilinen bir CH 50 değeri ile tahlil yapılır her zaman bir kontrol serumu test etmek ve bilinen serum kontrol kabul edilen değer üretmek için kritik öneme sahiptir. SRBC ve haemolysin farklı partiler arasında herhangi bir fark olup olmadığını belirlemek için bir yolu, bazal düzeyde hemoliz ya da CH 50 değer herhangi bir değişiklik olup olmadığını, standart bir serum birkaç kez örneği karşı yeni bir test malzemeleri test etmek ve daha sonra belirlemek için kontrol serumu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazar Miss Lora Matthews sinematografi teknikleri ve Bay Paul Shepherd gerçekleştirmek için teşekkür etmek istiyorum. Bu proje, Güney Avustralya Üniversitesi, Tıp Laboratuarı programı tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sheep red blood cells | CSL | 2490201 | Use at 1% final |
| Serum | Human serum | ||
| Rabbit Anti-Sheep Haemolytic serum (RBCs), Unconjugated | AbD Serotec | C12HSB | |
| 96 well flat bottom plate | Sarstedt Ltd | 83.1839 | |
| Veronal buffered saline | Use at 1x final | ||
| Waterbath | |||
| Plate reader | |||
| 37°C room/incubator |
References
- Goldsby, R. A., Kindt, T. J., Osborne, B. A., Kuby, J. Immunology. , W.H. Freeman. (2003).
