מדידת משלים Haemolytic 50% (CH ₅₀) פעילות של סרום

Summary

מסלול קלאסי מופעל על ידי נוגדן ו לשיאו תמוגה תא היעד. CH

Abstract

מערכת המשלים היא קבוצה של חלבונים אשר מופעלים כאשר להוביל היעד תמוגה התא ומקל phagocytosis דרך opsonisation. רכיבים משלימים הפרט ניתן לכמת אך זה אינו מספק כל מידע על הפעילות של מסלול. CH

Protocol

הכנת תמיסת מלח 5x שנאגרו ורונל (VBS)

1. כדי להכין את תמיסת מלח שנאגרו ורונל (VBS), שלושה פתרונות שונים צריכים להיות מוכנים.
2. הכן פתרון 1 על ידי המסת 21.25gm של NaCl ו 0.94gm של Barbitone נתרן 350ml של מים מזוקקים. הריכוזים הסופי של NaCl נתרן Barbitone הם 1.02M ו 13 מ"מ בהתאמה.
3. הכן פתרון 2 על ידי המסת 1.44gm של Barbitone ב 125ml של מים מזוקקים חמים. הריכוז הסופי של Barbitone הוא 62.5mM.
4. הכן פתרון 3 על ידי המסת 20.33gm של MgCl ₂ ו 4.41gm של CaCl ₂ ב 100 מ"ל של מים מזוקקים. הריכוז הסופי של MgCl ₂ ו CaCl ₂ הוא 2.18M ו 440mM בהתאמה.
5. מיקס פתרונות 1 ו 2 ו להתקרר לטמפרטורת החדר.
6. לאחר פתרון משולב מתקרר, להוסיף 1.25ml של פתרון 3 ולהתאים את ה-pH על 7.3-7.5 באמצעות 1M HCl.
7. התאמת עוצמת השמע הסופי 500ml עם מים מזוקקים להכין פתרון מניות 5x.
8. כדי להכין פתרון עובד 1x, לדלל את המניות 1:05 עם מים מזוקקים.

Sensitisation של כדוריות דם אדומות כבשים עם haemolysin

1. הכן את haemolysin ידי ראשית דילול זה 1:50 עם VBS
2. כדי 4ml של SRBC להוסיף 6ml של VBS לערבב בעדינות על ידי היפוך
3. צנטריפוגה ב 600g x 5minutes
4. בטל supernatant לשטוף את התאים עוד 2 פעמים
5. לאחר לשטוף הסופי, צנטריפוגה התאים ב 900g 5minutes x לארוז את התאים
6. בטל supernatant ו resuspend התאים VBS מספיקות כדי להכין את הפתרון של 10% כלומר 0.5ml של תאים הם ארזו resuspended ב 5 מ"ל של חיץ
7. Dropwise להוסיף נפח שווה של haemolysin (ארנב נגד כבשים נוגדן כדוריות דם אדומות) אל התאים בעוד מתערבל ברציפות
8. לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות באמבט מים
9. בעדינות מערבבים את כל התאים 15minutes
10. SRBC Sensitised ניתן לאחסן לילה ב -4 ° C

CH ₅₀ assay

1. לייבל סדרה של צינורות כפולים עם 1:08, 1:16, 1:32, 1:64 ו - 1:128.
2. הכינו סדרה של שני דילולים סדרתי לקפל שליטה בסרום מבחן VBS כל כפולים
3. התחלה בשעה 1:04 (100 מ"ל + 300 מ"ל סרום VBS) ולהעביר 200 מ"ל של דגימה לתוך הצינור שכותרתו הבא.
4. מערבבים היטב בין דילולים ו 200 מ"ל להעביר דילול הבא עם קצה פיפטה טריים.
5. חזור על הפעולה עד כל חמשת דילולים נעשים.
6. מחק 200 מ"ל של דילול 1:128 הסופי.
7. מוסיפים 200 מ"ל של SRBC רגיש מושעה לכל הצינורות.
8. Two לייבל צינורות נפרדים כמו ריק להוסיף 200 מ"ל של רגיש SRBC + 200 מ"ל VBS. צינורות אלה ימדוד תמוגה ספונטנית של SRBC ב VBS.
9. לייבל עוד שני צינורות נפרדים כמו תמוגה סה"כ ולהוסיף 200 מ"ל מים 200 מ"ל + SRBC רגיש מזוקקים.
10. בעדינות מערבבים את כל הצינורות.
11. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ב waterbath ערבוב לאחר 15 דקות.
12. צנטריפוגה דגימות ב 1500 גרם במשך 5 דקות עד המשקע RBCs.
13. העברה של 100 מ"ל supernatant מהצינור כל לבאר בצלחת 96 תחתית שטוחה היטב.
14. מוסיפים 100 מ"ל מים מזוקקים היטב כל אחד.
15. קרא את ספיגת של דגימות ב 540nm באמצעות ספקטרופוטומטר צלחת.

חישובים

1. חישוב ממוצע ספיגת עבור כל דגימה
2. הפחת ספיגת ריק (תמוגה ספונטנית) של כל הדגימות
3. חישוב תמוגה% עבור כל דילול באמצעות הנוסחה הבאה:
   
4. מגרש תמוגה אחוז (הציר האנכי) לעומת דילול בסרום על הציר האופקי.
5. חישוב הדילול הנדרש haemolysis 50% שליטה ואת הבדיקה בסרום (איור 2).

נציג תוצאות:

וידאו כולל דוגמה תוצאות נציג. בפועל, סרום שליטה מנוהלת גם באותו זמן כמו סרום הבדיקה מטופלת באותו אופן. להלן (טבלה 1) הוא נתונים לדוגמה ממדגם סרום נבדק. הנתונים מניפולציות על פי המשוואה המוצגת 5.3.

מדגם	OD 540	ממוצע
ריק	0.042, 0.044	0.043
סך תמוגה	0.183, 0.183	0.183
מהילה	OD 540	ממוצע	ממוצע-Blank	% תמוגה
01:08	0.200, 0.219	0.210	0.168	116
01:16	0.179, 0.173	0.176	0.134	93
01:32	0.134, 0.110	0.122	0.08	55
1:64	0.053, 0.066	0.059	0.017	12
1:128	0.044, 0.045	0.045	0.003	2

באיור 1. הפעלה של מסלול משלים הקלאסית. מסלול קלאסי מופעל באמצעות קשירה אימונוגלובולינים-M (IgM) או אימונוגלובולינים-g (IgG) על פני השטח של תא המטרה. החלק Fc של Ab נקשר C1q, C1r מופעל וזה בתורו מפעיל אחר מולקולה של C1r אשר יחד להפעיל שתי מולקולות של C1s. C1s עכשיו cleaves C4 החושפת את אתר הקישור ל-C2 אשר ביקע גם. הכריכה של C4b ו C2a מוביל להיווצרות ממכלול המכונה convertase C3. קומפלקס זה עכשיו cleaves C3 להרכיב C3a ו C3b, שחלקם משלבים עם convertase C3 להרכיב convertase C5. קומפלקס זה עכשיו פועל C5, עם C5b שהתקבל מחייב C6 ליזום היווצרות של הקרום מורכבים ההתקפה (MAC). C5b6 פועל C7, אשר במעשה להפעיל C8, ובסופו של דבר על C9 וכתוצאה מכך היווצרות של MAC הסופי. (Goldsby et al, 2003).

איור 2. שרטוט של נתונים לדוגמה וחישוב CH50 עבור פקד ו מדגם הבדיקה בסרום. (א), אחוז מחושב (%) תמוגה שליטה הן (•) ולבדוק () דגימות סרום הם זממו נגד גורם לדילול. (ב) כדי לחשב את תמוגה 50%, קו מצויר מהערך אחוז 50% עד מצטלב עם קווי הגרף ואז קו אנכי נמשך עד הדילול. בדוגמה זו, דילול של פי 35 מכלל שליטה ועל פי 21.6 דילול של סרום הבדיקה נדרשים להשיג תמוגה 50%. נתונים אלה מראים כי יש להשלים פחות נוכח בסרום במבחן לעומת שליטה כפי שהוא נדרש דילול לפני פחות תמוגה 50% הושג. המדגם לשלוט גם מראה תמוגה> 100% בדילול 01:08. זהו ככל הנראה בשל תמוגה שלם של SRBC על ידי המים מזוקקים תמוגה יעיל יותר של רכיבים משלימים.

Discussion

Assay ₅₀ CH כפוף הפרעות רבות. SRBC כמה הם שבירים יותר מאחרים, וכתוצאה מכך haemolysis ספונטנית כי הוא לא קשור כדי להשלים פעילות. הזיקה של הנוגדן ארנב משתנה הרבה הרבה מיצרן אחד למשנהו; זה משפיע על כמות נוגדן אשר נקשר SRBC. כמו כן, תהליך של רגישות SRBC עם תוצאות הנוגדנים בתאים עם כמויות שונות של ציפוי הנוגדן SRBC. אוסף הדגימה אחסון הם מקור פוטנציאלי חשוב של טעות. רכיבים משלימים כגון C1q, C3, C4 ו-C5 הם יציב מאוד, טיפול מדגם נאותה כך הוא קריטי. חשיפה ממושכת לחום יקטין פעילות משלימים יפיק שברים פעילים של רכיבים משלימים. כדי לזהות כמו מקורות רבים של טעות ככל האפשר, חשוב לבדוק בסרום שליטה עם ערך ידוע ₅₀ CH בכל פעם assay מבוצעת כדי לשחזר את הערך המקובל של השליטה בסרום ידוע. דרך אחת לקבוע אם יש הבדלים בין קבוצות שונות של SRBC ו haemolysin היא לבחון חומרים הבדיקה החדשה נגד מדגם סטנדרטי של מספר פעמים בסרום ולאחר מכן לקבוע אם יש שינויים ברמת הבסיס של haemolysis או ערך CH ₅₀ עבור בסרום הבקרה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sheep red blood cells	CSL	2490201	Use at 1% final
Serum			Human serum
Rabbit Anti-Sheep Haemolytic serum (RBCs), Unconjugated	AbD Serotec	C12HSB
96 well flat bottom plate	Sarstedt Ltd	83.1839
Veronal buffered saline			Use at 1x final
Waterbath
Plate reader
37°C room/incubator