השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

Summary

אנו להדגים פרוטוקול ליצור עוברי דג הזברה chimeric להתנהגות הדמיה לחיות הסלולר במהלך embryogenesis.

Abstract

תאים לשנות בהרחבה במקומות ורכושם במהלך embryogenesis. שינויים אלה מוסדר על ידי יחסי הגומלין בין התאים לבין סביבתם. עוברים chimeric, אשר מורכב של תאים בעלי רקע גנטי שונה, הם כלי נהדר ללימוד תאים תאים אינטראקציות בתיווך גנים של עניין. השקיפות של דג הזברה העובריים בשלבים התפתחותיים מוקדם היתרי להדמיה ישירה של המורפוגנזה של רקמות ואיברים ברמה התאית. הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול ליצור הרשתיות chimeric והמוח עוברי דג הזברה ולבצע הדמיה חיה של תאים התורם. פרוטוקול מכסה את הכנת מחטים ההשתלה, השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים התורמות GFP שלילי המארחים, ועל בחינה של התנהגות תורם התא תחת מיקרוסקופ confocal לחיות. עם שינויים קלים, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי ללמוד את ההתפתחות העוברית של רקמות ואיברים אחרים דג הזברה. היתרונות של שימוש GFP לתאי התורם התווית הם דנו גם.

Protocol

ביום 1. הכנה

1. הגדר חוצה דגים

הגדר חוצה pairwise של דג הזברה בערב. כדי למנוע הזדווגות אקראית לפני הזמן הרצוי להשתמש חוצצים להפריד את הדג נקבה וזכר את קלטות ההזדווגות. GFP-לבטא דג מהונדס משמשים כמקור בלסטומרים התורם. השורה pt104 מהונדס (Zou et al., 2008), משמש כאן, מבטא GFP בכל מקום בגוף בשליטת היזם EF1. ביטוי של GFP מאפשרת ויזואליזציה של תאים מתורם חי על ידי הדמיה. אחרים הקווים דגים מהונדס המבטאים חלבוני ניאון מתאים ניתן להשתמש לצרכים ספציפיים.

2. הכן בצורת טריז agarose בארות לקיום העובר

יוצקים agarose 1% נמס, מוכן במים ביצה E3 (Westerfield, 2007), לתוך צלחת פטרי. Float תבנית פלסטיק כי יש בצורת טריז בליטות על הפתרון agarose ולתת פתרון agarose לחלוטין לחזק. מוציאים את התבנית בזהירות לטבול את המיטה agarose עם מים E3.

3. הכן מחטים השתלה

השתמש חולץ מחט אנכי (דוד KOPF מכשירים) בהספק הגדרה 11.5 לעשות מחטים על ידי משיכת pipettes זכוכית נימי (Precision כלי העולמי). טיפים מחט טוב צריך להתחדד עם פירים ארוכה. טוחנים את הטיפים המחט בזווית של 45 מעלות עם מטחנת Micro (Marishige) עד פתחים משופעים של 40-45μm בקוטר פנימי מתקבלים (איור 1A). כדי לנקות את עצות מחט, לצרף צינור בקצה הקהה של המחט, לחבר את הצינור מזרק, ולאחר מכן להתחנף ולשחרר פתרון 10% חומצה הידרופלואורית עד שכל פסולת גלוי מוסר. לאחר מכן, לשטוף עם מים מזוקקים עצות, ואחריו 100% אתנול. אוויר יבש המחטים עד שכל מתאדה אתנול. חשוב להבטיח כי טיפים הינם יבשים לחלוטין: אתנול שיורית יהרוס את המחטים במהלך שלב בטמפרטורה גבוהה ליטוש. כדי לרכך ולהבריק את הקצוות הגסים של מחט טיפים, עצות לאפות את המחט עם החום שנוצר על ידי נימה של זייפן Micro (Marishige). אל תתנו עצות מחט לגעת נימה במהלך ליטוש. כמות החשמל עובר אף נימה ואת המרחק בין החוט לבין עצות מחט יכול להיות מותאם כדי להשיג תנאים החימום הרצוי. הטמפרטורה לא צריך להיות גבוה מדי: זה יהיה להמיס לעוות את הטיפים מחט. אחרי הקצוות הגסים הם והחליק בזהירות לגעת נימה מחומם עם קצה מחט ולאחר מכן משוך בעדינות את החוט מן המחט כדי ליצור הקצה המחודד (איור 1B). מחט חד, חלק, נקי הוא קריטי להשגת בלסטומרים התורם שלם בשביל לא לפגוע בעוברים המארח.

4. הכנת תחקיר העובר, מיצוב

משוך פיפטה כוס על אש הגז להשיג בדיקה זכוכית בסדר עם סוף והחליק. בדיקה זו תשמש לתפקיד עוברים בכיוון הנכון לקראת ההשתלה.

יום 2. Blastomere השתלה

1. איסוף עוברים dechorionate

למחרת, להסיר את המחיצות בין קלטות לחצות לאפשר דגים להזדווג. מניחים את העוברים בצלחת פטרי מלא מים E3. לאחר מכן, עוברים dechorionate באופן ידני על ידי קורעת את chorions מעוברים עם זוג מלקחיים בסדר. השתמש פיפטה זכוכית עם פיר התכופפה בזהירות העברת עוברים dechorionated agarose לתוך בארות. הימנעי מכל מגע של עוברים עם האוויר, הגורמת עוברים להתפוצץ. בואו העוברים להתפתח 28.5 מעלות צלזיוס בארות agarose עד 3 שעות שלאחר ההפריה, או hpf.

2. הגדרת מנגנון השתלה

בעוד העוברים לפתח, להקים מנגנון ההשתלה על ידי חיבור מחט השתלה של שמן מינרלי מלא מערכת מיקרו שאיבה. ודא כי המערכת אינה נזילה ואין בועות אוויר לכודות במערכת. חזרה למלא את המחט השתלת שלם עם שמן מינרלי, למעט 0.5-1 μl של שטח בפתיחת קצה.

3. השתלה של בלסטומרים

כדי השתלת בלסטומרים, השתמש בדיקה מיצוב זכוכית להתמצא הצד blastomere עוברים 3-4-hpf כלפי מעלה. ואז, בעדינות להכניס את המחט לתוך השתלת העובר תורם לאט להתחנף 5-20 בלסטומרים לתוך המחט. הכנס את המחט blastomere מלא לעובר מארח ולשחרר את בלסטומרים לאט. האתר שבו בלסטומרים משתחררים ישפיע שבו הצאצאים שלהם בתרגום בשלבים התפתחותיים מאוחר יותר. כדי לנתח את התפתחות המוח ואת רשתית, התאים לשחרר בקוטב בעלי חיים. במהלך ההשתלה, לוודא כי קצה מחט לא פנה האוויר. כדי למזער נזקים מכניים, עוברים המארח יהיה להשאיר את הבארות agarose ב 28.5 ° C עד למחרת. ואז, לאransfer את העוברים על פסיפס של 24 צלחות היטב מראש מצופה מ"ל 0.5 agarose של 1%, עם עובר אחד טוב כל אחד. 1 מ"ל מים ביצה E3 מתווסף גם כל אחד. כדי למנוע זיהומים חיידקיים, הוסף 10 μl של 100x פניצילין וסטרפטומיצין למים ביצה E3.

יום 3. הטבעת הדמיה של עוברים לחיות פסיפס

1. הטבעת עוברים

הכן 1.5% נקודת התכה נמוכה agarose (LMP) במים ביצה E3 ולשמור את פתרון אמבט מים 30 מעלות צלזיוס. העברת העובר פסיפס על צלחת תרבות FluoroDish רקמה עם תחתית כוס 0.17mm עובי (מכשירים העולם Precision). הסרה של עודפי מים E3 לעזוב את העובר מכוסה רק על ידי כמות מינימלית של E3. הוסף 30-50 μl LMP 1.5% נמס לעובר. במהירות למצב העין או המוח קרוב לתחתית הכוס ככל האפשר לפני הפתרון agarose מתמצק. לאחר הפתרון מתקרר, להוסיף פתרון נוסף agarose להמשיך לאבטח את העוברים במקום. לאחר מכן, לטבול את הקרושה agarose לחסום עם מים 2-3 ביצים E3 מ"ל.

2. Confocal הדמיה

עבור מיקרוסקופיה confocal, מטרה הפוכה טבילה במים (אולימפוס, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, יפן) עם עומק מוקד גדול משמש. טיפת מים נוסף על המטרה ואז במקום רקמת FluoroDish תרבות צלחת על המטרה. כדי פיתוח תמונה, לבצע זמן לשגות הדמיה על ידי לקיחת תמונות של עוברים כל 5 דקות. בהתאם לאופי של ניסויים, מרווחי הזמן בין הזריקות צריך להיות מותאם.

נציג תוצאות

איור 2 ממחיש נציג 24-hpf דג הזברה פסיפס. ביטוי של GFP מדגיש את התאים התורם בירוק. התאים neuroepithelial רשתית טווח עובי כל קיר הרשתית.

הסרט מראה את התנועות של תורם התאים במוח לארח בבית hpf 24. תאים מורפולוגיות שימו לב להשתנות עם הזמן.

באיור 1. צורות של טיפים מחט ההשתלה. א פתיחת משופעים של קצה מחט היה חופשי של פסולת לאחר שוטף חומצה הידרופלואורית. ב הקצה המחודד נוצר בקצה המחט.

איור 2. ויזואליזציה של ה-GFP-לבטא בתאי התורם עוברי דג הזברה chimeric ב hpf 24. הלוח השמאלי מציג את אותות ה-GFP במוח הרשתית. הלוח המרכזי הוא תמונה בשדה בהיר של העובר. הפאנל הימני מראה את התמונה הממוזג.

סרט 1. הדמיה חיה של תאים GFP תורם חיובי הראו שינויים נרחבים מורפולוגיות של תאים neuroepithelial המוח במהלך ההתפתחות. מסגרות בודדות של הסרט נאספו כל 5 דקות בין 24 לבין 25 hpf. לחץ כאן כדי לראות את הסרט .

Discussion

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה blastomere השתלת לנתח את התפתחות המוח ואת רשתית דג הזברה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לנתח את ההתפתחות של רקמות ואיברים אחרים, פשוט על ידי שחרור בלסטומרים התורם למקומות המתאימים את העוברים המארח. תיוג עם מולקולות ה-GFP התשואות רקע נקי יותר עם תיוג פלורסנט צבען מצומדות dextran (הו ו קיין 1990). הסיבה לכך היא פסולת של צבעים dextran מתאי התורם מת נמשך הרבה יותר זמן מאשר ה-GFP, ובכך הסיק עם הדמיה (קטלנו et al. 2007). בנוסף, ה-GFP חיובי התורם תאים בריאים יותר מאשר אלה המכילים צבעי dextran.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 ¾" Glass pipette	Fisher Scientific	13-678-30
Borosilicate Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
FluoroDish	World Precision Instruments, Inc.	FD35
Vertical Needle / pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 720
Micro Grinder	Marishige	EG-400
Micro Forge	Marishige	MF-830
Manual Microsyringe Pump	World Precision Instruments, Inc.	MMP
Forceps	Fine Science Tools	11232-20
Hydrofluoric Acid	Fisher Scientific	A147-1
Penicillin- Streptomycin	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Agarose	Research Products International Corp.	9012-36-6
Low melting agarose	Fisher Scientific	BP165-25
E3 egg water: 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO4 0.1% methylene blue
5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO4 0.1% methylene blue
5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO4 0.1% methylene blue