Transplantatie van GFP-expressie blastomeren voor Live Beeldvorming van het netvlies en de ontwikkeling van de hersenen in chimère zebravis embryo's
Summary
Demonstreren we een protocol om chimere zebravis embryo's te genereren voor live-imaging cellulaire gedrag tijdens de embryogenese.
Abstract
Cellen veranderen uitgebreid in hun locaties en vastgoed tijdens de embryogenese. Deze veranderingen worden geregeld door de interacties tussen de cellen en hun omgeving. Chimère embryo's, die zijn samengesteld uit cellen van verschillende genetische achtergrond, zijn grote hulpmiddelen om de cel-cel interacties gemedieerd door genen van belang te bestuderen. De embryonale transparantie van de zebravis in vroege ontwikkelingsstadia maakt directe visualisatie van de morfogenese van weefsels en organen op cellulair niveau. Hier tonen we een protocol om chimerisch netvlies en de hersenen in zebravis embryo's te genereren en te leven beeldvorming van de donor cellen uit te voeren. Het protocol heeft betrekking op de voorbereiding van de transplantatie naalden, de transplantatie van GFP-expressie donor blastomeren om GFP-negatieve gastheren, en het onderzoek van de donor cel gedrag onder wonen confocale microscopie. Met lichte wijzigingen, kan dit protocol ook gebruikt worden om de embryonale ontwikkeling van andere weefsels en organen in de zebravis studie. De voordelen van het gebruik van GFP te labelen donor cellen worden ook besproken.
Protocol
Discussion
In deze video tonen we een methode voor blastomeer transplantatie in het netvlies en de ontwikkeling van de hersenen te analyseren in de zebravis. Dit protocol kan ook worden gebruikt om de ontwikkeling van andere weefsels en organen te analyseren door simpelweg het vrijgeven van de donor blastomeren overeenkomstige plaatsen in de ontvangende embryo's. De etikettering met GFP moleculen levert een schonere achtergrond dan labeling met fluorescente kleurstof-geconjugeerde Dextran (Ho en Kane 1990). Dit komt omdat het …
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door een National Institutes of Health (NIH) Core Grant (5P30EY008098) en de volgende middelen om XW: NIH Grant R01EY016099 en Onderzoek naar Blindness Career Development Award Prevent. Wij danken Kira Lathrop voor hulp bij confocale beeldvorming.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5 ¾” Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | ||
| Borosilicate Glass Capillary | WPI (World Precision Instruments, Inc.) | 1B100F-4 | ||
| FluoroDish | WPI | FD35 | ||
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | ||
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | ||
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | ||
| Manual Microsyringe Pump | WPI | MMP | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | ||
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | ||
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | ||
| Agarose | RPI (Research Products International Corp.) | 9012-36-6 | ||
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 |
E3 egg water:
- 5 mM NaCl
- 0.17 mM KCl
- 0.33 mM CaCl2
- 0.33 mM MgSO4
- 0.1% methylene blue
References
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
